老年小鼠伏隔核多巴胺D1受體表達(dá)下調(diào)參與異氟醚麻醉后蘇醒延遲

張益，桂歡，胡浪，劉程曦，張潔，梁小麗，3△

蘇醒延遲是指在全身麻醉結(jié)束1 h后，患者仍然對指令或刺激缺乏有意識反應(yīng)的現(xiàn)象［1］，常發(fā)生于老年患者。近來的研究顯示，老年患者發(fā)生全麻后蘇醒延遲的原因除肝腎功能退化導(dǎo)致藥物代謝與排除減慢以外，大腦的老年性改變導(dǎo)致對全麻藥物反應(yīng)性的減退也可能是重要原因［2-3］。大腦中多巴胺能通路在自然睡眠和全身麻醉的蘇醒過程中均扮演著重要的角色，其中位于腹側(cè)紋狀體的伏隔核（NAc）含有大量的多巴胺受體，是腦內(nèi)重要的多巴胺能相關(guān)核團(tuán)之一。新近的研究發(fā)現(xiàn)，通過光遺傳學(xué)方法激活伏隔核中表達(dá)多巴胺D1受體的中型棘突神經(jīng)元（MSNs）可導(dǎo)致動物從自然睡眠中覺醒［4］。同時(shí)，靜脈注射多巴胺D1受體激動劑可顯著縮短大鼠異氟醚麻醉后的恢復(fù)時(shí)間［5］，提示伏隔核內(nèi)的多巴胺D1受體可能在全身麻醉的蘇醒過程中發(fā)揮重要作用。另一方面，腦內(nèi)多巴胺能通路易受到老年化的影響，老年動物大腦中多個(gè)區(qū)域的多巴胺能神經(jīng)元、各種亞型的多巴胺受體以及多巴胺遞質(zhì)與青年動物相比均顯著減少，其中就包括了伏隔核內(nèi)的多巴胺D1受體［6］。然而，老年動物麻醉后蘇醒延遲與伏隔核中多巴胺D1受體的老年性改變是否有關(guān)目前尚不明確。因此，本研究通過比較老年和青年小鼠經(jīng)異氟醚誘導(dǎo)麻醉后的蘇醒時(shí)間、皮層腦電活動以及伏隔核D1受體在異氟醚麻醉中促覺醒的能力，探討老年動物麻醉后蘇醒延遲的相關(guān)機(jī)制，為尋求更加安全的老年麻醉方案及藥物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級雄性C57BL/6老年小鼠（18～22月齡）及青年小鼠（5～8月齡）各26只，購自長沙天勤生物技術(shù)有限責(zé)任公司［許可證號：SCXK（湘）2014-0011］。異氟醚購自山東魯南貝特制藥公司；D1受體激動劑SKF-82958與拮抗劑SCH-23390購自美國Sigma-Aldrich公司；D1受體一抗及相應(yīng)二抗購自英國Abcam公司。主要儀器：Model3000微電極放大器（美國A-M system公司），Micro1401數(shù)模轉(zhuǎn)換器（英國CED公司），氣體監(jiān)測儀（上海德爾格醫(yī)療設(shè)備有限公司），小動物麻醉盒及腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司）。微量注射泵（Legato?130，美國KD科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 老年和青年小鼠蘇醒時(shí)間及皮層腦電測定采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取老年小鼠與青年小鼠各8只，腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，固定于腦立體定位儀上，切開頭皮暴露顱骨，于前額葉皮層（前囟前1.8 mm，中線0.0 mm，深度2.5 mm）中放置皮層腦電記錄電極，電極植入手術(shù)后待傷口恢復(fù)1周行正式實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠置于小動物麻醉盒中，給予3%異氟醚誘導(dǎo)至翻轉(zhuǎn)反射消失，連接腦電記錄裝置并將異氟醚濃度調(diào)整至1.4%，運(yùn)載氣體為1 L/min氧氣+1 L/min空氣，維持30 min后運(yùn)用抽氣泵將麻醉盒內(nèi)廢氣抽出，直至異氟醚濃度為0。由此刻至小鼠翻轉(zhuǎn)反射恢復(fù)的時(shí)間記為蘇醒時(shí)間，同時(shí)記錄麻醉和恢復(fù)過程的皮層腦電圖（electroencephalogram，EEG）。

1.2.2 微注射模型的建立取剩余小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后，將小鼠固定于腦立體定位儀上，切皮暴露顱骨，根據(jù)小鼠腦圖譜［7］將雙側(cè)伏隔核微注射引導(dǎo)套管置于伏隔核上方0.5 mm處（前囟前1.54 mm，中線旁開±0.7 mm，深度4.50 mm）。同時(shí)將皮層腦電電極置于前額葉皮層中，通過骨水泥固定。術(shù)后前3 d，每日注射青霉素20 000 U抗感染，術(shù)后恢復(fù)1周開始正式實(shí)驗(yàn)。共建立老年和青年微注射模型各18只，老年組隨機(jī)分為老年激動劑組（A-ago組）、老年拮抗劑組（A-ant組）和老年對照組（A-C組）3個(gè)亞組；青年組同樣隨機(jī)分為青年激動劑組（Y-ago組）、青年拮抗劑組（Y-ant組）以及青年對照組（Y-C組）3個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

1.2.3 微注射模型行為學(xué)實(shí)驗(yàn)及腦電記錄將小鼠置于小動物麻醉盒中，給予3%異氟醚誘導(dǎo)翻轉(zhuǎn)反射消失，將微注射套管與動物頭部的引導(dǎo)套管相連，同時(shí)連接腦電記錄系統(tǒng)。此后將異氟醚調(diào)整為1.4%并維持。在第28 min時(shí)，老年和青年激動劑組通過微注射泵注射D1受體激動劑SKF-82958（5μg/0.5μL每側(cè)），老年和青年拮抗劑組注射D1受體拮抗劑SCH-23390（5μg/0.5μL每側(cè)），老年和青年對照組給予相同體積的生理鹽水。注射完成后，微注射套管繼續(xù)留置于注射部位1 min，以便藥物有效擴(kuò)散。拔出注射套管后停止異氟醚吸入并抽出廢氣，記錄蘇醒時(shí)間和EEG。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有小鼠采用60 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，由心臟灌注生理鹽水后，再緩慢灌注4%多聚甲醛進(jìn)行固定，隨后取腦組織放置于4%多聚甲醛中24 h，再置于30%蔗糖溶液中脫水直至沉于溶液。隨后行伏隔核冠狀切片，確定微注射套管位置是否準(zhǔn)確。若導(dǎo)管位置不在伏隔核內(nèi)，則剔除該實(shí)驗(yàn)動物數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)過程中置管不準(zhǔn)確4只，微注射模型死亡1只，均及時(shí)補(bǔ)充相同鼠齡小鼠，重新建立模型行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 腦電分析皮層腦電圖分析采用Spike2軟件包（英國CED公司）完成。將原始腦電信號通過高通濾波分為慢波（0～1 Hz），δ（＞1～4 Hz），θ（＞4～8 Hz），α（＞8～12 Hz），β（＞12～25 Hz）和γ（＞25～60 Hz）頻段。每只小鼠所有頻段能量與自身總能量比值作歸一化處理，比較不同組間各頻段的相對能量值。

1.2.5 Western blot法檢測伏隔核多巴胺D1受體蛋白表達(dá)水平行為學(xué)及腦電記錄完成后，腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，快速斷頭取腦，分離伏隔核。在伏隔核組織中加入細(xì)胞裂解液，提取蛋白，通過BCA法行蛋白定量。取等量的蛋白樣本通過SDS-PAGE電泳分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜和封閉后，加入多巴胺D1受體一抗（1∶500）于4℃下孵育過夜，經(jīng)洗膜后加入驢抗兔二抗（1∶8 000），室溫下孵育1 h后通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）曝光成像。運(yùn)用Image J軟件檢測蛋白條帶灰度值，通過目標(biāo)條帶與內(nèi)參蛋白β-actin灰度值的比值來反映D1受體的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析作圖均采用Graphpad Prism 6.01軟件完成。正態(tài)性檢驗(yàn)通過Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)完成，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，老年與青年小鼠指標(biāo)比較采用t檢驗(yàn)，各組內(nèi)3個(gè)亞組之間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Sidak法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 老年和青年小鼠異氟醚麻醉后蘇醒時(shí)間及皮層腦電圖變化老年組小鼠麻醉后蘇醒時(shí)間較青年組顯著延長；同時(shí)在蘇醒期老年組小鼠δ頻段的能量較青年小鼠顯著升高，而其α、β和γ頻段的能量較青年小鼠明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of emergence time after isoflurane anesthesia and power of all bands in cortical EEG between aged mice and young mice表1老年和青年小鼠異氟醚麻醉后蘇醒時(shí)間及皮層EEG各頻段能量的比較 （n=8，±s）

Tab.1 Comparison of emergence time after isoflurane anesthesia and power of all bands in cortical EEG between aged mice and young mice表1老年和青年小鼠異氟醚麻醉后蘇醒時(shí)間及皮層EEG各頻段能量的比較 （n=8，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別青年組老年組t蘇醒時(shí)間（s）218.50±42.60 369.10±69.47 5.228＊＊皮層EEG各頻段能量慢波0.014±0.006 0.014±0.004 0.088 δ θ α β γ 0.355±0.048 0.445±0.046 3.829＊＊0.234±0.021 0.236±0.014 0.857 0.118±0.010 0.104±0.009 2.945＊0.171±0.026 0.134±0.017 3.347＊＊0.123±0.027 0.082±0.019 3.523＊＊

2.2 老年和青年小鼠麻醉后覺醒能力變化 在青年小鼠中，Y-ago組的蘇醒時(shí)間明顯短于Y-C組，同時(shí)在皮層EEG上δ頻段能量減少，β、γ頻段能量增加；Y-ant組的蘇醒時(shí)間則明顯長于Y-C組，皮層EEG上δ頻段能量增加，見表2。在老年小鼠中，Aago組與A-ant組的蘇醒時(shí)間和皮層EEG變化與AC組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

Tab.2 The effects of microinjecting D1 agonist and antagonist into the nucleus accumbens on the emergence time and power of all bands in cortical EEG in young mice表2青年小鼠伏隔核給予D1受體激動劑和拮抗劑對異氟醚麻醉后蘇醒時(shí)間及皮層EEG各頻段能量的影響（n=6，±s）

Tab.2 The effects of microinjecting D1 agonist and antagonist into the nucleus accumbens on the emergence time and power of all bands in cortical EEG in young mice表2青年小鼠伏隔核給予D1受體激動劑和拮抗劑對異氟醚麻醉后蘇醒時(shí)間及皮層EEG各頻段能量的影響（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與Y-C組比較，P＜0.05

組別Y-C組Y-ago組Y-ant組F蘇醒時(shí)間（s）276.30±39.21 207.70±26.49a 331.20±33.39a 20.548＊＊皮層EEG各頻段能量慢波0.017±0.007 0.013±0.003 0.019±0.005 1.658 δ θ α β γ 0.395±0.023 0.320±0.031a 0.443±0.034a 25.842＊＊0.237±0.027 0.246±0.028 0.255±0.016 0.799 0.117±0.006 0.120±0.017 0.112±0.014 0.617 0.156±0.021 0.180±0.027a 0.131±0.015a 7.771＊＊0.095±0.029 0.135±0.027a 0.060±0.014a 14.438＊＊

Tab.3 The effect of microinjecting D1 agonist and antagonist into the nucleus accumbens on the emergence time and power of all bands in cortical EEG in aged mice表3老年小鼠伏隔核給予D1受體激動劑和拮抗劑對異氟醚麻醉后蘇醒時(shí)間及皮層EEG各頻段能量的影響（n=6，±s）

Tab.3 The effect of microinjecting D1 agonist and antagonist into the nucleus accumbens on the emergence time and power of all bands in cortical EEG in aged mice表3老年小鼠伏隔核給予D1受體激動劑和拮抗劑對異氟醚麻醉后蘇醒時(shí)間及皮層EEG各頻段能量的影響（n=6，±s）

均P＞0.05

組別A-C組A-ago組A-ant組F蘇醒時(shí)間（s）385.50±73.83 340.30±62.22 408.30±52.04 1.792皮層EEG各頻段能量慢波0.014±0.005 0.015±0.007 0.015±0.006 0.092 δ θ α β γ 0.443±0.051 0.402±0.066 0.436±0.081 0.659 0.234±0.016 0.250±0.016 0.226±0.047 0.999 0.104±0.011 0.109±0.012 0.100±0.025 0.374 0.133±0.018 0.142±0.029 0.138±0.033 0.178 0.086±0.017 0.097±0.029 0.100±0.024 0.558

2.3老年和青年小鼠伏隔核中多巴胺D1受體的表達(dá)水平的比較與青年小鼠相比，老年小鼠伏隔核中多巴胺D1受體的表達(dá)明顯下調(diào)（t=4.294，P＜0.01），見圖1。

Fig.1 Comparison of D1 receptor expressions in NAc between aged and young mice圖1老年和青年小鼠伏隔核中多巴胺D1受體的表達(dá)比較

3 討論

研究顯示，大腦的老年化改變可增加其對全身麻醉藥物的敏感性，從而導(dǎo)致麻醉后蘇醒延遲［2］。本研究也發(fā)現(xiàn)，老年小鼠在異氟醚麻醉后蘇醒時(shí)間較青年小鼠明顯延長，同時(shí)在皮層腦電圖上慢波較青年小鼠增強(qiáng)而快波減弱，在大腦層面提示其蘇醒期麻醉水平更深，說明老年小鼠大腦在蘇醒期對異氟醚麻醉的反應(yīng)和青年小鼠存在著明顯的差異，但其具體的神經(jīng)機(jī)制尚不明確。

伏隔核中95%以上的神經(jīng)元為MSNs，MSNs是一種γ-氨基丁酸（GABA）能的抑制性神經(jīng)元，其上表達(dá)有大量的多巴胺D1和D2受體［8］。近來的研究發(fā)現(xiàn)伏隔核在睡眠覺醒過程中發(fā)揮著重要的作用，其中表達(dá)多巴胺D1受體的MSNs興奮后可促進(jìn)自然睡眠的覺醒［4］,但伏隔核的多巴胺D1受體是否也在全身麻醉的覺醒過程中發(fā)揮重要作用，目前尚少見相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，向伏隔核中微注射多巴胺D1受體的激動劑可以明顯縮短異氟醚麻醉后的蘇醒時(shí)間，而拮抗其中的多巴胺D1受體又可延長其蘇醒時(shí)間，提示伏隔核D1受體可能是腦內(nèi)調(diào)控全身麻醉覺醒的結(jié)構(gòu)之一。激活MSNs上表達(dá)的D1受體可將神經(jīng)元膜電位去極化，由此興奮MSNs［9］。伏隔核的MSNs興奮后抑制其投射區(qū)域，如中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）的GABA能中間神經(jīng)元，使VTA內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元去抑制［10］；而VTA的多巴胺神經(jīng)元已被證實(shí)是全身麻醉覺醒的重要神經(jīng)集合，激活后可促進(jìn)多種麻醉藥物的蘇醒過程［10-11］，這可能是伏隔核D1受體促麻醉覺醒的重要機(jī)制之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在老年動物的大腦中，伏隔核D1受體促進(jìn)麻醉覺醒的能力明顯降低，向伏隔核中注射D1受體激動劑和拮抗劑對老年小鼠異氟醚麻醉后的蘇醒時(shí)間和皮層EEG均無明顯影響，其機(jī)制可能與老年小鼠伏隔核中D1受體的表達(dá)減少有關(guān)。大腦內(nèi)多巴胺受體的表達(dá)極易受到老年化的影響，包括D1受體在內(nèi)的多種多巴胺受體亞型的表達(dá)在自然衰老的大腦中均有明顯減少［12］。盡管多巴胺遞質(zhì)的合成能力并不受老年化的影響［13］，但由于可結(jié)合的受體密度下降，各腦區(qū)內(nèi)與多巴胺受體相關(guān)的功能將隨著年齡的增加而減弱。

綜上所述，伏隔核中多巴胺D1受體興奮可促進(jìn)異氟醚麻醉的蘇醒，但D1受體的這種促覺醒作用在老年大腦中顯著減弱，可能與老年小鼠伏隔核中D1受體表達(dá)減少有關(guān)。