涼血消銀顆粒劑對銀屑病轉基因小鼠模型miR-155/SOCS1軸的影響

段紫鈺，李建國，陳靜，劉鴻偉，李麗娜，周武，張守民

銀屑病俗稱牛皮癬，中醫學稱之為白疕，臨床表現為真皮炎性反應、皮膚異常增殖、肉眼可見的紅斑脫屑等癥狀［1］。銀屑病一般多發于青壯年，全身各部位均可發病，具有病程長、易復發、治愈難等特點［2］。涼血消銀顆粒劑具有清熱涼血、活血化瘀、通絡、抗腫瘤、抗菌抗炎、增強免疫活性、抑制銀屑病表皮細胞增殖的功效［3］，但是其治療銀屑病的作用機制尚不明確。微小RNA-155（microRNA-155，miR-155）/細胞因子信號轉導抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）通路在多種疾病中發揮重要作用，miR-155與人體免疫系統有關，研究發現miR-155在B細胞、T細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞等免疫細胞的細胞增殖、炎癥反應中起促進作用［4］。SOCS1是miR-155重要的靶基因，能夠負向調控Janus激酶（Janus kinase，Jak）/信號轉導和轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路［5-7］。涼血消銀顆粒劑能否通過調節miR-155/SOCS1軸以緩解銀屑病癥狀尚少見報道。本研究擬通過測定涼血消銀顆粒劑對轉基因銀屑病小鼠miR-155、SOCS1、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-23、IL-6、IL-1表達水平的影響，探究其治療銀屑病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器涼血消銀顆粒劑的組成成分為：紫草15 g、赤芍10 g、白花蛇舌草15 g、生地20 g、槐花15 g、丹參15 g、水牛角15 g、白茅根10 g、雞血藤15 g、丹皮10 g、熟地20 g，為我院中藥自制劑；甲氨蝶呤（＞98%）購自上海源葉生物科技有限公司，批號S18026；TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號E-EL-M0049c、E-EL-M0731c、EEL-M0044c、E-EL-M0038c；總RNA提取試劑盒購自北京金克隆生物科技有限公司，批號EX1882-50T；miR-155引物及內參U6引物序列由北京安必奇生物科技有限公司合成；兔抗鼠SOCS1、兔抗鼠內參β-actin、羊抗兔二抗均購自美國Bioworld公司，批號AC6015、AC5113、AC5719。電泳槽和轉膜槽購自美國Bio-Rad公司；奧林巴斯CX33顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；Evolution 200紫外-可見分光光度計購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗動物與分組K14-VEGF轉基因小鼠（銀屑病模型，SPF級）24只，按隨機數表法分為模型組、涼血消銀顆粒劑組和甲氨蝶呤組，每組8只；未經任何處理的遠交系Swiss小鼠（FVB/NJ）8只（對照組），均購自鄭州大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（豫）2017-0001，實驗動物使用許可證號SYXK（豫）2017-0012，動物質量合格證號2018030912，全部小鼠雌雄各半，體質量約25 g。隨機分籠飼養動物，標準飼料喂養并自由飲水，每隔3 d更換墊料，溫度設置為25℃，濕度（60±10）%。涼血消銀顆粒劑給藥時用生理鹽水稀釋，以60 g/kg劑量灌胃給藥（成人劑量的20倍），每日1次［3］；甲氨蝶呤以2 mg/kg劑量灌胃給藥，每日1次［8］；對照組、模型組每天灌胃等體積的生理鹽水。

1.3 實驗動物取材各組小鼠給藥10 d在1%戊巴比妥鈉0.06 mL/g腹腔麻醉后，鼠尾采血，25℃靜置20 min后，5 000 r/min離心30 min，吸取上清液置于-80℃冰箱中保存。脫頸處死后立即剪取相應受損處皮膚組織，轉移至-80℃冰箱儲存。

1.4 涼血消銀顆粒劑治療效果評價用嚴重程度指數（psoriasis area and severity index，PASI）評分評價涼血消銀顆粒劑的治療效果。使用照相機對各組小鼠同一病損皮膚部位進行拍照觀察，按照PASI評分標準對小鼠進行評分，PASI評分標準［9］：對小鼠病損皮膚部位的浸潤厚度、紅斑、鱗屑情況分別進行0～4分賦值，小鼠的皮膚病損情況越嚴重，分值越高。

1.5 HE染色評價病理嚴重程度將固定后的各組小鼠受損皮膚組織石蠟包埋，切片（3μm左右）。將切片用二甲苯常規脫蠟，將脫蠟后的切片依次用二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水洗脫，然后脫水。蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化30 s，50℃溫水浸泡5 min，然后脫水。伊紅染色2 min，脫水、透明、中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達水平嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，顯色后，用多功能酶標儀測定樣品在450 nm處的吸光度（A），根據標準曲線計算TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1水平。

1.7 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qPCR）檢測miR-155表達水平嚴格按照說明書提取皮膚組織總mRNA，使用紫外分光光度計測定mRNA在260/280 nm處紫外吸光度值，A260/280＞1.8表明純度合格，置于-80℃冰箱儲存備用。miR-155引物序列：上游5′-TTAATGCTAATTGTGATAGGGGT-3′，下 游5′-ACCCCTATCACAATTAGCATTAA-3′；內 參U6上 游5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。qPCR反應體系20μL，其中SYBRPremix ExTaqTMⅡ10μL，cDNA 2 μL，Rox Re-ference DyeⅡ（50×）0.4μL，miR-155上、下游引物各0.8μL，ddH2O 6μL。采用兩步法，每個樣本均做6個復孔，反應條件：95℃預變性30 s；94℃變性30 s，65℃退火30 s，75℃延伸15 s，40個循環；75℃終末延伸5 min。采用2-ΔΔCt法對miR-155水平定量分析。

1.8 蛋白質印跡法（Western blot）測定SOCS1蛋白表達水平從-80℃冰箱中取出待測樣品，加入200μL裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、苯甲基磺酰氟），勻漿至無組織碎塊，離心取上清。嚴格按照BCA試劑盒說明書測定總蛋白含量，每組設置6個復孔。加入樣品1/4體積的5×Loading buffer，加熱至100℃，持續5 min。穩壓電泳（100 V），至樣品進入分離膠，加大電壓至120 V，直至Loading buffer到達分離膠底部。濕法轉膜，5%BSA室溫封閉1 h。加入兔抗鼠SOCS1、兔抗鼠內參β-actin，稀釋比例均為1∶1 000，4℃孵育過夜，用PBS清洗，加入羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育，PBS清洗，用顯色劑顯色、曝光。用凝膠成像設備觀察。

1.9 統計學方法使用SPSS 22.0版軟件對數據進行統計分析。計數資料以例（%）表示，行χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）形式表示，多組比較行單因素方差分析，多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 涼血消銀顆粒劑治療后PASI評分對比4組間PASI評分比較差異有統計學意義（F=68.062，P＜0.01，n=8）。與對照組（0）相比，模型組PASI評分顯著升高（3.25±0.26，P＜0.05）；與模型組相比，涼血消銀顆粒劑組（2.13±0.24）、甲氨蝶呤組（1.88±0.25）PASI評分顯著降低（P＜0.05）；后兩組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 涼血消銀顆粒劑治療后HE染色結果對照組基底層細胞保持完整，血管周圍及真皮淺層未見炎癥細胞浸潤；模型組表現為棘層增厚、表皮突下延、角化過度伴角化不全、真皮淺層淋巴細胞浸潤，基本符合銀屑病病理特征；涼血消銀顆粒劑組和甲氨蝶呤組小鼠病理嚴重程度顯著降低，細胞形態有所恢復，見圖1。

Fig.1 HE staining results after treatment with Liangxue Xiaoyin granule in four groups(×200)圖1涼血消銀顆粒劑治療后各組HE染色結果（×200）

2.3 各組小鼠血清中TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達水平與對照組相比，模型組TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，涼血消銀顆粒劑組、甲氨蝶呤組TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達水平顯著降低（P＜0.05）；涼血消銀顆粒劑組與甲氨蝶呤組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of the expression levels of serum TNF-α,IL-23,IL-6 and IL-1 after treatment between four groups表1治療后各組小鼠血清中TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達水平比較 （n=8，ng/L，±s）

Tab.1 Comparison of the expression levels of serum TNF-α,IL-23,IL-6 and IL-1 after treatment between four groups表1治療后各組小鼠血清中TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達水平比較 （n=8，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組涼血消銀顆粒劑組甲氨蝶呤組F TNF-α 87.29±12.34 164.65±14.07a 113.29±11.19ab IL-23 85.39±8.41 181.94±17.62a 114.87±15.93ab IL-6 55.95±15.26 126.82±17.95a 75.33±14.42b IL-1 35.97±8.14 81.49±10.26a 64.77±10.39ab 108.13±8.97ab 62.138＊＊122.08±10.94ab 69.510＊＊73.18±13.91b 31.304＊＊60.08±10.45ab 29.109＊＊

2.4 治療后小鼠受損皮膚組織中miR-155、SOCS1表達水平與對照組相比，模型組miR-155表達水平顯著升高，SOCS1表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，涼血消銀顆粒劑組、甲氨蝶呤組miR-155表達水平顯著降低，SOCS1表達水平顯著升高（P＜0.05）；后兩組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表2。

Fig.2 The expression of SOCS1 in the damaged skin tissue detected by Western blot assay in four groups圖2 Western blot檢測各組小鼠受損皮膚組織中SOCS1表達水平

Tab.2 Comparison of miR-155 and SOCS1 expression levels in damaged skin tissues after treatment between four groups表2治療后各組小鼠受損皮膚組織中miR-155、SOCS1表達水平比較 （n=8，±s）

Tab.2 Comparison of miR-155 and SOCS1 expression levels in damaged skin tissues after treatment between four groups表2治療后各組小鼠受損皮膚組織中miR-155、SOCS1表達水平比較 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組涼血消銀顆粒劑組甲氨蝶呤組F miR-155/U6 1.09±0.34 1.84±0.43a 1.36±0.22b 1.33±0.19b 8.204＊＊SOCS1/β-actin 0.80±0.21 0.28±0.06a 0.47±0.09ab 0.46±0.11ab 22.131＊＊

3 討論

3.1 涼血消銀顆粒劑治療銀屑病的研究現狀銀屑病病因復雜，其與感染、遺傳、代謝、環境、免疫功能、精神和內分泌因素等有關［10］。甲氨蝶呤是臨床上治療銀屑病的常用藥，主要針對癥狀進行治療，可減緩患者臨床表現，但是在用藥過程中存在并發癥［11］。

中醫理論認為，銀屑病患者化燥生風、營血虧損、肌膚失養、血熱內蘊等引起，反映在患者的肌膚中就是血瘀、血燥、血熱［12］。從血論治是中醫界較為認可的治療銀屑病一種觀點，涼血消銀顆粒劑以生地為君藥，具有清熱涼血、養陰生津的作用，水牛角、槐花、紫草為臣藥以增強清熱涼血功效［13］。曹麗楠［14］研究發現涼血消銀湯能夠改善進行期銀屑病患者臨床癥狀，降低血清中IL-1、IL-6、TNF-α表達水平，提高臨床療效。孫濤［3］發現涼血消銀顆粒治療的銀屑病患者有效率高，2年復發率低，提示使用涼血消銀顆粒治療臨床效果好，能降低復發率。本研究發現，與對照組相比，模型組PASI評分顯著升高，棘層增厚、表皮突下延、角化過度伴角化不全、真皮淺層淋巴細胞浸潤，即提示浸潤厚度、紅斑、鱗屑加重，證明模型制備成功。與模型組相比，涼血消銀顆粒劑組、甲氨蝶呤組PASI評分顯著降低，病理嚴重程度顯著降低，細胞形態有所恢復，提示涼血消銀顆粒劑治療能夠緩解銀屑病癥狀，對銀屑病有較好的治療效果，與臨床常用藥甲氨蝶呤相當，表明涼血消銀顆粒劑有望成為臨床上治療銀屑病備選藥物。

3.2 涼血消銀顆粒劑對銀屑病小鼠炎癥反應的影響銀屑病發生發展進程中，炎癥因子發揮重要作用，IL-6一般由巨噬細胞、單核細胞分泌，有助于角質細胞增生，促進銀屑病發展，與其嚴重程度呈正相關［15］。IL-1能夠活化B細胞、T淋巴細胞且能夠介導體液免疫，銀屑病患者血清中IL-1水平明顯高于健康人群，提示IL-1水平與銀屑病發生發展相關［16］。IL-23是促炎性細胞因子，參與機體自身免疫疾病和控制感染，在銀屑病患者血清中高表達，與銀屑病發病相關［17］。TNF-α能夠參與機體炎癥反應，促進角質形成細胞增生，其水平與銀屑病患者皮損面積呈正相關［18］。本研究發現，與對照組相比，模型組小鼠血清TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達水平顯著升高，提示銀屑病的發生伴隨細胞炎癥因子過表達；與模型組相比，涼血消銀顆粒劑組、甲氨蝶呤組TNF-α、IL-23、IL-6、IL-1表達水平顯著降低，涼血消銀顆粒劑組與甲氨蝶呤組相比無差異，提示經治療后細胞炎癥因子水平下降，銀屑病小鼠體內炎癥反應得到緩解，但是涼血消銀顆粒劑通過何種通路下調細胞炎癥因子表達水平還有待進一步研究。

3.3 涼血消銀顆粒劑對銀屑病小鼠miR-155/SOCS1信號通路的影響銀屑病的發病過程涉及多種信號通路參與，研究發現異丙酚能夠抑制miR-155表達水平，上調SOCS1水平來減輕小膠質細胞對脂多糖（LPS）的神經炎癥反應，提示異丙酚可能通過miR-155/SOCS1信號通路下調細胞炎癥因子水平，緩解炎癥反應［19］。此外，還有研究發現miR-155能夠促進吸血蟲感染早期炎癥反應，通過負調控SOCS1水平參與吸血蟲感染患者病情的進展［20］。本研究發現，與對照組相比，模型組miR-155表達水平顯著升高，SOCS1表達水平顯著降低，提示miR-155/SOCS1信號通路可能參與銀屑病小鼠炎癥反應；進一步分析發現，與模型組相比，涼血消銀顆粒劑組、甲氨蝶呤組miR-155表達水平顯著降低，SOCS1表達水平顯著升高，涼血消銀顆粒劑組與甲氨蝶呤組相比無差異，提示涼血消銀顆粒劑能夠下調miR-155表達水平、上調SOCS1表達水平，可能通過抑制miR-155/SOCS1軸活化而緩解銀屑病小鼠病癥。

綜上所述，涼血消銀顆粒劑可能通過抑制miR-155/SOCS1軸活化，降低炎癥反應，進而緩解銀屑病小鼠病癥，推測其有望成為臨床上治療銀屑病的備選藥。但是，由于本研究樣本量較小，且并不能完全代表人類銀屑病的發病過程，因此需要擴大樣本量并從細胞水平進一步驗證。