茶多酚對(duì)早期齲進(jìn)展的影響

馬麗，陳靜，郭愛花，張向宇△

齲病是發(fā)生于牙體硬組織的一種細(xì)菌感染性疾病，在導(dǎo)致牙齒緩慢破壞的同時(shí)還會(huì)對(duì)身心健康造成影響［1］。有研究顯示，對(duì)尚未形成齲洞的早期齲通過(guò)改善口腔衛(wèi)生習(xí)慣或化學(xué)藥物處理（如氟化物、封閉劑）可減緩齲損進(jìn)展［2-3］，尋找能夠阻斷早期齲進(jìn)展的藥物是預(yù)防和治療齲病的重要方向。天然產(chǎn)物茶多酚（tea polyphenol，TP）由于性質(zhì)穩(wěn)定、毒副作用輕微，一直是防齲阻斷劑研究中的熱點(diǎn)［4］。大量研究發(fā)現(xiàn)茶多酚可以抑制致齲菌（如變異鏈球菌）在牙面上的黏附和聚集，干擾致齲菌獲得性薄膜的形成［5-6］，但在齲的發(fā)展過(guò)程中除了致齲菌外，牙齒脫礦及再礦化程度同樣會(huì)影響齲齒的進(jìn)展。Hiraishi等［7］研究證實(shí)天然產(chǎn)物橙皮苷可通過(guò)穩(wěn)定膠原進(jìn)而抑制牙本質(zhì)脫礦。而有關(guān)茶多酚在早期齲進(jìn)展中對(duì)牙齒硬組織影響的研究較少，且結(jié)論不一。本研究選取天然產(chǎn)物茶多酚為實(shí)驗(yàn)藥物，通過(guò)建立牛牙早期齲模型及體外pH循環(huán)實(shí)驗(yàn)，模擬口腔環(huán)境下牙齒的脫礦及再礦化過(guò)程，觀察茶多酚對(duì)早期齲進(jìn)展的影響，同時(shí)評(píng)價(jià)其與氟化物的聯(lián)合作用效果，為今后開發(fā)安全有效的天然防齲制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集新鮮拔除的3歲齡黃牛的切牙20顆。茶多酚（產(chǎn)品型號(hào)：L30226524；純度：96%）購(gòu)自北京索萊寶科學(xué)技術(shù)有限公司。氟化鈉（NaF，分析純）購(gòu)自上海生工生物有限公司。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示茶多酚的最小抑菌濃度為2 g/L，因此選擇該濃度作為茶多酚實(shí)驗(yàn)藥物濃度；氟抑齲的有效濃度為1 mg/L，因此選取該濃度作為NaF實(shí)驗(yàn)藥物濃度。

1.2 脫礦液、再礦化液及緩沖液的配制參照文獻(xiàn)［7］的方法配制脫礦液及釉質(zhì)再礦化液。脫礦液由50 mmol/L乙酸、1.5 mmol/L氯化鈣、0.9 mmol/L磷酸二氫鉀配制，用氫氧化鉀調(diào)整pH值為5.0。釉質(zhì)再礦化液由1.5 mmol/L氯化鈣、0.9 mmol/L磷酸二氫鉀、130 mmol/L氯化鉀、20 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）緩沖液配制，用氫氧化鉀調(diào)整pH值為7.0。釉質(zhì)再礦化液中加入400 mg/L膠原酶Ⅰ配制成牙本質(zhì)再礦化液。參照文獻(xiàn)［8］的方法配制緩沖液，由130 mmol/L氯化鉀、20 mmol/L HEPES配制，用氫氧化鉀調(diào)整pH值為7.0。

1.3 早期齲樣本的制備將20顆切牙牙冠制備成6 mm×6 mm×2 mm釉質(zhì)塊［8］，經(jīng)包埋、磨平、拋光后，在10%磷酸溶液中浸泡10 s。釉質(zhì)邊緣涂抹指甲油覆蓋，僅留出5 mm×5 mm窗口。另取根部牙體組織，制備成牙本質(zhì)標(biāo)本。共制備牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)標(biāo)本各24塊。將牙釉質(zhì)與牙本質(zhì)標(biāo)本浸入100 mL的脫礦液中，置于37℃臺(tái)式恒溫培養(yǎng)搖床（天津市歐若儀器儀表有限公司，HNY型號(hào)）中96 h使其脫礦，以模擬早期齲的病理改變。將制備好的牙釉質(zhì)齲及牙本質(zhì)齲標(biāo)本分別采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組（n=6）：空白對(duì)照組（DW組）、氟化鈉組（NaF組）、茶多酚組（TP組）、茶多酚與氟化鈉聯(lián)合應(yīng)用組（TP+NaF組）。

1.4 pH循環(huán)實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行pH循環(huán)實(shí)驗(yàn)，步驟如下：標(biāo)本于脫礦液（1 mL）、實(shí)驗(yàn)溶液（1 mL）和再礦化液（1 mL）中依次浸泡14 h、2 h、8 h，每次更換浸泡液時(shí)在緩沖液中超聲蕩洗5 min。整個(gè)pH循環(huán)在37℃恒溫培養(yǎng)搖床下保持8 d，pH循環(huán)結(jié)束后收集脫礦液和再礦化液。其中，DW組的實(shí)驗(yàn)溶液為再礦化液，NaF組為含1 mg/L氟化鈉的再礦化液，TP組的實(shí)驗(yàn)溶液為含2 g/L茶多酚的再礦化液，TP+NaF組的實(shí)驗(yàn)溶液為含2 g/L茶多酚及1 mg/L氟化鈉的再礦化液。

1.5 脫礦液中鈣、磷離子流出值的測(cè)定收集第1、8天pH循環(huán)后的脫礦液，采用全自動(dòng)生化分析儀（D320，SINNOWA）測(cè)定鈣、磷離子濃度。將第1天pH循環(huán)后測(cè)得的鈣、磷離子濃度作為鈣、磷流出基線值，pH循環(huán)結(jié)束后的脫礦液中的鈣、磷離子濃度作為總鈣、磷離子流出量，鈣、磷離子的相對(duì)釋放量為總鈣、磷離子流出量與鈣、磷流出基線值的比值。

1.6 表面顯微硬度的測(cè)定通過(guò)顯微硬度計(jì)（MHV-2000型，上海滬工高峰工具有限公司）檢測(cè)pH循環(huán)后所有樣本表面的維氏硬度（surface microhardness，SMH）。每個(gè)樣本在與表面中線垂直處取6個(gè)點(diǎn)，測(cè)量其硬度值，取平均值。

1.7 X線能譜分析樣本的鈣磷比參照文獻(xiàn)［9］的方法處理樣本，基本操作如下：將pH循環(huán)后的標(biāo)本置于2.5%戊二醛中固定24 h，去離子水超聲蕩洗，梯度乙醇（50%、70%、90%、100%）逐級(jí)脫水各10 min，干燥后噴金。X線能譜分析儀（Oxford Inea Energy300，荷蘭）放大500倍檢測(cè)鈣磷原子含量，同一樣本不同區(qū)域重復(fù)測(cè)量3次，取平均值，并計(jì)算鈣磷比。

1.8 羥脯氨酸水平的測(cè)定采用羥脯氨酸酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（上海篤瑪生物科技有限公司）檢測(cè)牙本質(zhì)再礦化液中羥脯氨酸水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脫礦液中鈣、磷離子相對(duì)釋放量在牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)的脫礦液中，NaF組鈣、磷離子相對(duì)釋放量均明顯低于DW組（P＜0.05）；TP組鈣、磷離子相對(duì)釋放量均明顯高于NaF組和TP+NaF組（P＜0.05），與DW組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；TP+NaF組與NaF組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of the relative amount of calcium and phosphate in demineralized fluids between four groups表1 4組脫礦液中鈣、磷離子相對(duì)釋放量的比較（n=6，±s）

Tab.1 Comparison of the relative amount of calcium and phosphate in demineralized fluids between four groups表1 4組脫礦液中鈣、磷離子相對(duì)釋放量的比較（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與DW組 比 較，b與NaF組 比 較，c與TP組比 較，P＜0.05

組別DW組NaF組TP組TP+NaF組F牙釉質(zhì)鈣0.90±0.06 0.48±0.02a 0.87±0.05b 0.48±0.05ac 18.100＊磷磷1.32±0.02 0.54±0.01a 1.25±0.02b 0.56±0.02ac 119.520＊牙本質(zhì)鈣0.82±0.04 0.26±0.03a 0.87±0.06b 0.28±0.02ac 63.130＊1.05±0.03 0.39±0.02a 1.06±0.04b 0.46±0.02ac 80.260＊

2.2 再礦化后標(biāo)本表面顯微硬度值牙釉質(zhì)表面顯微硬度值NaF組和TP+NaF組均高于DW組和TP組（P＜0.05），TP組與DW組以及TP+NaF組與NaF組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；牙本質(zhì)表面顯微硬度值NaF組、TP組和TP+NaF組均高于DW組，NaF組和TP+NaF組高于TP組（P＜0.05），TP+NaF組與NaF組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Tab.2 Comparison of microhardness of ename and dentin surface between four groups表2 4組牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)表面顯微硬度值比較（n=6，HV，±s）

Tab.2 Comparison of microhardness of ename and dentin surface between four groups表2 4組牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)表面顯微硬度值比較（n=6，HV，±s）

＊P＜0.05；a與DW組比較，b與NaF組比較，c與TP組比較，P＜0.05

組別DW組NaF組TP組TP+NaF組F牙釉質(zhì)3 234.86±148.05 3 804.57±60.90a 3 333.00±156.30b 3 707.00±78.81ac 33.053＊牙本質(zhì)206.40±6.66 312.80±7.85a 222.80±2.60ab 320.00±8.08ac 471.051＊

2.3 X射線能譜分析樣本鈣磷比在pH循環(huán)結(jié)束后的牙釉質(zhì)表面，NaF組、TP組和TP+NaF組鈣磷比均高于DW組（P＜0.05），NaF組、TP組和TP+NaF組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在牙本質(zhì)表面，NaF組、TP組和TP+NaF組鈣磷比均高于DW組（P＜0.05），TP組低于NaF組和TP+NaF組（P＜0.05），TP+NaF組與NaF組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

Tab.3 Comparison of calcium and phosphate ratios of enamel and dentin surface after pH circulation between four groups表3 4組pH循環(huán)后牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)標(biāo)本表面鈣磷比的比較 （n=6，±s）

Tab.3 Comparison of calcium and phosphate ratios of enamel and dentin surface after pH circulation between four groups表3 4組pH循環(huán)后牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)標(biāo)本表面鈣磷比的比較 （n=6，±s）

＊P＜0.05；a與DW組比較，b與NaF組比較，c與TP組比較，P＜0.05

組別DW組NaF組TP組TP+NaF組F牙釉質(zhì)1.30±0.14 1.65±0.09a 1.57±0.15a 1.62±0.16a 6.272＊牙本質(zhì)1.44±0.13 1.94±0.12a 1.61±0.12ab 1.92±0.15ac 20.352＊

2.4 再礦化液中羥脯氨酸水平NaF組和TP+NaF組牙本質(zhì)再礦化液中羥脯氨酸水平均低于DW組和TP組（P＜0.05），TP組與DW組以及TP+NaF組與NaF組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

Fig.1 Comparison of hydroxyproline concentrations in dentin remineralization solution between four groups圖1 4組牙本質(zhì)再礦化液中羥脯氨酸水平的比較

3 討論

齲病是牙體硬組織脫礦與再礦化失衡引發(fā)的。在牙體硬組織脫礦階段，牙菌斑中致齲菌分解碳水化合物產(chǎn)生有機(jī)酸，這些酸匯聚在菌斑與牙齒界面，形成一定的濃度梯度［10］。當(dāng)pH達(dá)到臨界值（pH=5.5）時(shí)，氫離子會(huì)擴(kuò)散至鈣化的牙齒組織中，開始較明顯的脫鈣脫磷過(guò)程。在此階段，若通過(guò)藥物等途徑促使再礦化占優(yōu)勢(shì)，礦物離子再沉積于脫礦區(qū)表面，就可以避免早期齲洞的形成。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)浸泡脫礦液使牙體組織表面脫礦的方式制備早期齲模型，通過(guò)pH循環(huán)實(shí)驗(yàn)?zāi)M齲的進(jìn)展過(guò)程。結(jié)果顯示，TP組鈣、磷離子相對(duì)釋放量與DW組無(wú)明顯差異，提示茶多酚不具有抑制牙體硬組織中鈣磷流出的作用，對(duì)于早期齲的脫礦無(wú)明顯影響，此結(jié)果與李繼遙等［11］的研究結(jié)果一致。然而，齊芳芳等［12］的研究結(jié)果表明茶多酚可以有效抑制早期人工根面齲中鈣離子流出，進(jìn)而抑制脫礦。進(jìn)一步探究原因后發(fā)現(xiàn)，研究結(jié)果不同可能與齲模型的造模方法不同有關(guān)。齊芳芳等［12］實(shí)驗(yàn)中所用的齲齒模型是在致齲菌的參與下構(gòu)建的，而茶多酚對(duì)于主要致齲菌——變形鏈球菌的抑制作用是明確的。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者推測(cè)茶多酚可通過(guò)抑制致齲菌的生長(zhǎng)及相關(guān)毒力因子的表達(dá)影響牙體硬組織的脫礦。

李繼遙等［11］采用測(cè)量顯微硬度值的方法來(lái)衡量牙釉質(zhì)表面的再礦化情況，結(jié)果顯示茶多酚對(duì)釉質(zhì)的再礦化無(wú)明顯的抑制或促進(jìn)作用，這與本實(shí)驗(yàn)中牙釉質(zhì)表面顯微硬度值的結(jié)果一致。但是，本研究采用X線能譜分析pH循環(huán)結(jié)束后牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)表面鈣磷比結(jié)果顯示，TP組在pH循環(huán)結(jié)束后的牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)表面的鈣磷比均高于DW組，提示在早期齲的進(jìn)展過(guò)程中，茶多酚可以促進(jìn)脫礦后牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)表面鈣磷離子的再沉積。分析本實(shí)驗(yàn)中pH循環(huán)后的牙齒標(biāo)本表面鈣磷比與顯微硬度值的結(jié)果出現(xiàn)差異的原因，可能是因?yàn)闄z測(cè)方法的差異造成的。顯微硬度的測(cè)量較為粗略，需要再礦化達(dá)到一定程度才能被測(cè)量出來(lái)，而X線能譜分析可以較為準(zhǔn)確地分析除氫和氦元素之外的其他各種元素，尤其是鈣、磷等元素的含量，其敏感度更高［13］。pH循環(huán)實(shí)驗(yàn)中，鈣、磷離子只是進(jìn)行了初步、有限的再沉積，因此，敏感度相對(duì)較高的能譜分析更能檢測(cè)這種輕微的變化。

Yu等［14］研究認(rèn)為多形性茶多酚可通過(guò)與牙本質(zhì)有機(jī)物結(jié)合來(lái)降低牙本質(zhì)的通透性，從而抑制牙體組織脫礦。張凌琳等［15］研究證實(shí)釉質(zhì)有機(jī)質(zhì)在中藥五倍子多酚性化合物（GCE）促進(jìn)早期釉質(zhì)齲再礦化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)有機(jī)質(zhì)去除或缺失時(shí)，GCE促進(jìn)早期釉質(zhì)齲再礦化的作用不顯著。Hiraishi等［7］提出牙本質(zhì)膠原作為礦物質(zhì)沉積的支架，在再礦化過(guò)程中可通過(guò)增強(qiáng)其穩(wěn)定性以便于礦物離子的重新沉積。羥脯氨酸是膠原分子特有的氨基酸，對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)可以反映基質(zhì)膠原的水解情況［16］。因此，為了分析茶多酚促進(jìn)再礦化的機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了再礦化液中羥脯氨酸水平，結(jié)果顯示，TP組牙本質(zhì)再礦化液中羥脯氨酸水平與DW組無(wú)明顯差異，提示茶多酚促進(jìn)牙本質(zhì)的再礦化并不是通過(guò)抑制膠原水解、穩(wěn)定膠原蛋白實(shí)現(xiàn)的，但是否依賴于有機(jī)物的支架作用，尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。有學(xué)者提出茶多酚所具有的多羥基結(jié)構(gòu)可發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，與鈣、鐵等金屬離子作用形成環(huán)狀螯合物并生成沉淀［4］。本研究中牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)表面鈣磷比的增高是否與茶多酚、鈣離子之間的反應(yīng)有關(guān)，其機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

氟化物作為一種再礦化劑，可以在釉質(zhì)晶格中形成氟磷灰石以增強(qiáng)對(duì)酸的抵抗力，同時(shí)影響唾液和牙齒界面進(jìn)行的脫礦和再礦化過(guò)程［17］。目前，含氟產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于齲齒臨床的預(yù)防并顯現(xiàn)出確切的臨床效果。但氟的安全范圍較窄，在理想劑量與有毒劑量間的界限較為模糊，高劑量的氟化物會(huì)導(dǎo)致牙齒和骨骼氟中毒，甚至誘導(dǎo)出變異鏈球菌的耐氟菌株［18-19］。因此，如何保持氟化物的理想劑量，使其以長(zhǎng)期穩(wěn)定的速率緩釋氟尚待進(jìn)一步解決。本實(shí)驗(yàn)嘗試將天然產(chǎn)物與氟化鈉聯(lián)合應(yīng)用，以期發(fā)揮天然產(chǎn)物的優(yōu)勢(shì)，在保留氟化物抑制牙齒硬組織脫礦、促進(jìn)再礦化作用的同時(shí)降低其毒副作用，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果未顯現(xiàn)有協(xié)同增強(qiáng)作用。這可能是由于氟化物先一步作用于牙面進(jìn)而阻礙其他藥物接觸牙面發(fā)揮作用，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)藥物作用的先后順序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果是否有影響仍需進(jìn)一步研究。有研究指出，茶多酚與氟混合處理牙面可以促進(jìn)鈣鹽沉積，提高釉質(zhì)的抗酸力［20］。與本研究結(jié)果不同，推測(cè)原因可能與選擇的氟化物、茶多酚劑量不同有關(guān)。前者實(shí)驗(yàn)中NaF和茶多酚的劑量分別為0.45 g/L和5 g/L，而本實(shí)驗(yàn)選擇的是1 mg/L的NaF和2 g/L的茶多酚。

綜上所述，天然產(chǎn)物茶多酚除了具有抑制致齲菌的作用外，還可通過(guò)促進(jìn)鈣磷離子的再沉積干預(yù)牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)的再礦化過(guò)程，進(jìn)而影響早期齲的進(jìn)展，這為應(yīng)用茶多酚防齲提供了新思路。