霧化吸入高滲鹽水對(duì)膿毒癥大鼠肺損傷的影響

樊菲菲，謝建剛，趙丹琿，王倩梅，程云會(huì)，劉傳明

膿毒癥是由感染所誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，當(dāng)宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)，可引起多器官功能障礙甚至危及生命。肺是膿毒癥發(fā)生時(shí)最容易也是最早被累及的靶器官之一，常表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。膿毒癥發(fā)生時(shí)，活化后的免疫調(diào)節(jié)因子高遷移率族蛋白B1(high-modility groupbox 1, HMGB1)可與Toll樣受體4(toll like receptor 4, TLR4)相互作用，通過(guò)核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)引起下游炎性因子釋放，加重全身炎癥反應(yīng)。NF-κB的核移位是誘導(dǎo)炎癥基因表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在SIRS和急性肺損傷(acute lung injury, ALI)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是導(dǎo)致ALI的重要機(jī)制[1]。近十年來(lái)靜脈輸入高滲鹽水被用于創(chuàng)傷失血性休克的液體復(fù)蘇；既往研究證實(shí)，高滲鹽水可通過(guò)抑制細(xì)胞或大鼠模型的NF-κB-IκB通路影響促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平[2]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)靜脈輸入高滲鹽水可通過(guò)抑制HMGB1途徑減輕嚴(yán)重?zé)齻笫蟮哪I臟及腸道損傷[3-4]。但在高滲鹽水容量復(fù)蘇過(guò)程中，患者容易出現(xiàn)嚴(yán)重心律失常[5]，具有較高的早期病死率及整體病死率，這可能與高滲鹽水替代大于約10%的血容量時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體凝血功能造成影響有關(guān)[5-6]。霧化吸入高滲鹽水被用于治療囊泡性肺間質(zhì)纖維化和新生兒毛細(xì)支氣管炎，且對(duì)創(chuàng)傷性休克大鼠肺損傷有保護(hù)作用[7]。本實(shí)驗(yàn)觀察了霧化吸入高滲鹽水對(duì)膿毒癥大鼠肺損傷的保護(hù)作用，并探討了其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用健康成年SD大鼠30只，體重250 g左右，空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(陜)2019-001。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前12 h大鼠禁食不禁水，同時(shí)給予腸外營(yíng)養(yǎng)70 kcal/d。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、高滲鹽霧化組，每組10只。

1.2主要儀器和試劑 超聲霧化機(jī)購(gòu)自江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；雙光束紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海天美科學(xué)儀器有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-1β、髓過(guò)氧化物酶(MPO)檢測(cè) ELISA試劑盒購(gòu)自Abcam公司；抗NF-κB p65抗體、抗TLR4抗體、抗HMGB1抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.3膿毒癥肺損傷大鼠模型的制備 采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)制備膿毒癥肺損傷大鼠模型，具體操作：用10%水合氯醛麻醉大鼠后下腹正中切口開(kāi)腹，環(huán)形結(jié)扎盲腸根部，并在距離盲腸末端約1 cm處切開(kāi)0.5 cm的切口，擠出糞便后回納盲腸入腹腔，常規(guī)縫合。高滲鹽霧化組在膿毒癥肺損傷模型制備成功后2 h給予霧化吸入高滲鹽水(0.9%氯化鈉注射液100 ml加入10%氯化鈉注射液30 ml配置成3%高滲鹽水130 ml)。假手術(shù)組打開(kāi)腹腔后常規(guī)縫合。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將造模不成功、死亡或因其他原因不符合要求的大鼠剔除；每組缺失大鼠通過(guò)隨機(jī)抽樣原則重新補(bǔ)齊，直到整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4霧化吸入操作方法 將高滲鹽霧化組大鼠分批放入20 cm×30 cm×40 cm大小的玻璃箱中，用鉆孔器在玻璃箱前方正中開(kāi)鑿一個(gè)直徑為2 cm的孔徑作為霧化進(jìn)氣孔，在玻璃箱后方靠邊界處開(kāi)鑿一個(gè)直徑約0.5 cm的孔徑作為排氣孔，將3%高滲鹽水10 ml加入超聲霧化器中，每次霧化吸入15 min，2次間隔3 h。術(shù)后正常進(jìn)食水，分別在霧化吸入6、24 h時(shí)處死大鼠。

1.5肺組織病理改變 將大鼠麻醉處死后，以4%多聚甲醛溶液固定肺組織，在不同部位取3塊肺組織，依次以乙醇脫水，石蠟包埋、切片、脫蠟、染色，以肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血程度、肺泡間隙增寬及炎性細(xì)胞滲出程度進(jìn)行病理學(xué)評(píng)價(jià)。每只大鼠取4張切片，每張切片觀察6個(gè)不同視野，分別記錄病理學(xué)評(píng)分，最后取平均值。

1.6肺組織濕干重比(W/D)和MPO測(cè)定 切取3組大鼠右肺，試紙吸干肺組織表面血液及黏液后稱重記錄濕重；然后60℃烘干24 h稱重記錄干重，計(jì)算W/D比值。準(zhǔn)確稱取肺組織，磷酸鹽緩沖液制備5%肺組織勻漿，40 000 r/min，30 min高速離心，棄上清，再加入磷酸鹽緩沖液超聲預(yù)處理90 s，37℃水浴15 min后再次離心，分光光度計(jì)測(cè)量樣本在490 nm處OD值，根據(jù)OD值換算MPO活性。

1.7血清炎性因子水平測(cè)定 取3組大鼠左心室血1 ml，放置室溫2 h，1000 r/min，20 min離心，取上清液置于-20℃保存，使用時(shí)逐漸恢復(fù)至20℃，與標(biāo)準(zhǔn)品混合，按ELISA試劑盒上的protocol操作。酶標(biāo)儀450 nm比色，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的比色值比較，計(jì)算大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.8肺組織NF-κB、TLR4、HMGB1表達(dá)測(cè)定 取3組大鼠右肺，將肺組織放入勻漿器中充分研磨后，加入PMSF裂解液，于冰上孵育30 min后，以4℃，12 000 r/min，5 min高速離心后取上清，用蛋白標(biāo)準(zhǔn)品將樣本蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，再按蛋白抽提試劑盒上protocol抽提細(xì)胞質(zhì)蛋白和核蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、分別加入NF-κB、TLR4、HMGB1一抗、孵育過(guò)夜、加入二抗孵育1 h后顯色定影，最后用Image-Pro Plus軟件分析目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參(β-actin)值。

2 結(jié)果

2.1肺組織病理學(xué)表現(xiàn) 假手術(shù)組支氣管結(jié)構(gòu)清楚，肺間質(zhì)可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，微血管無(wú)充血，肺泡內(nèi)無(wú)滲出。模型組肺泡腔內(nèi)大量滲出，肺泡間明顯增寬、塌陷，肺間質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)大量炎性細(xì)胞，微血管充血、淤血。高滲鹽霧化組肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減少，微血管淤血程度明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)(SP×400)

2.2肺組織損傷指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組肺組織病理學(xué)評(píng)分、肺組織W/D值、MPO顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，高滲鹽霧化組肺組織病理學(xué)評(píng)分、肺組織W/D值、MPO顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1、圖2。

圖2 3組大鼠肺組織損傷指標(biāo)比較

表1 3組大鼠肺組織損傷指標(biāo)比較

2.3血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，高滲鹽霧化組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著下降(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

圖3 3組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

表2 3組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.4肺組織NF-κB、TLR4、HMGB1蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，高滲鹽霧化組HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表3、圖4。

圖4 3組大鼠肺組織NF-κB、TLR4、HMGB1蛋白表達(dá)水平比較

表3 3組大鼠肺組織NF-κB、TLR4、HMGB1蛋白表達(dá)比較

3 討論

膿毒癥繼發(fā)ALI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，主要病理生理學(xué)改變?yōu)榉尾慷喾N炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、移位，促炎因子和抗炎因子的表達(dá)改變；血管通透性增大，炎性分泌物產(chǎn)生，透明膜形成及凝血功能異常等[8]；引起肺順應(yīng)性下降和通氣/血流比例失調(diào)[9]，導(dǎo)致通氣功能障礙，臨床表現(xiàn)為頑固性低氧血癥和肺部滲出的增加[10]。生理狀態(tài)下，肺間質(zhì)、細(xì)支氣管及肺泡間隔中存在中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，可吞噬進(jìn)入下呼吸道的感染性、毒性及致敏性物質(zhì)[11]。HMGB1和NF-κB廣泛存在于細(xì)胞核內(nèi)，HMGB1可穩(wěn)定核染色體和調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯；NF-κB是核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的一種，負(fù)責(zé)前炎性因子和細(xì)胞生存基因的表達(dá)，在生理狀態(tài)下NF-κB與有抑制作用的IκB結(jié)合[12]。

既往研究證明，膿毒癥時(shí)大量炎性因子及內(nèi)毒素釋放入血，誘導(dǎo)肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集、活化、釋放、延遲凋亡；同時(shí)促進(jìn)巨噬細(xì)胞大量釋放HMGB1，當(dāng)HMGB1與其內(nèi)源性配體TLR4在細(xì)胞外結(jié)合后會(huì)進(jìn)一步激活MyD88依賴性途徑[13-14]。在炎性因子作用下，IκB磷酸化后活化，NF-κB與IkB形成的三聚體會(huì)發(fā)生降解，導(dǎo)致NF-κB脫離并激活，被激活的NF-κB能迅速到達(dá)細(xì)胞核的位置發(fā)揮自身作用；當(dāng)HMGB1/TLR4/NF-κB/IκB信號(hào)通路被激活后會(huì)產(chǎn)生大量的IL-1β、IL-6、細(xì)胞因子和趨化因子、前炎性介質(zhì)(如TNF-α)等[15]。炎性因子和前炎性因子可直接損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，造成肺水腫；同時(shí)能刺激中性粒細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)和正反饋促進(jìn)HMGB1分泌，激發(fā)機(jī)體炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而加重ALI[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組肺泡腔內(nèi)大量滲出，肺泡間明顯增寬、塌陷，肺間質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)大量的炎性細(xì)胞，微血管充血淤血等病理學(xué)改變；且模型組肺W/D值、肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平及血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著增加。說(shuō)明膿毒癥可增加肺部炎癥浸潤(rùn)程度；HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路被激活在膿毒癥肺損傷的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。

霧化吸入高滲鹽水在臨床上多用于治療囊泡性纖維癥和新生兒細(xì)支氣管炎，可能是通過(guò)減輕肺泡巨噬細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞聚集及細(xì)胞表面黏附因子表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)；同時(shí)提高氣道表面液體水平，改善氣道黏膜纖毛運(yùn)輸效力[17]。小劑量靜脈輸入高滲鹽水溶液也用于失血及創(chuàng)傷性休克的液體復(fù)蘇。Mitra等[18]發(fā)現(xiàn)高滲鹽水可減少?gòu)?fù)蘇所需的液體量；還在模型細(xì)胞及模型動(dòng)物水平上證實(shí)了高滲鹽水可通過(guò)抑制NF-κB-IκB通路影響幾種促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，從而起到保護(hù)作用。Wohlauer等[7]報(bào)道，在失血性休克動(dòng)物模型中，早期容量復(fù)蘇時(shí)，應(yīng)用霧化吸入高滲鹽水的措施，可通過(guò)減少內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎性前介質(zhì)而起到減輕ALI的目的；其作用機(jī)制是在不改變中性粒細(xì)胞肺內(nèi)聚集情況下，降低了基質(zhì)金屬蛋白酶-13表達(dá)，保證了終末氣道肺泡基膜的完整性；基質(zhì)金屬蛋白酶-13已被證實(shí)與由敗血癥引起的ALI發(fā)展關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高滲鹽霧化組肺部炎癥程度、肺部W/D明顯減輕，血清IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)及肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)均下降，證實(shí)了霧化吸入高滲鹽水可能是通過(guò)HMGB1/TLR4/NF-κB途徑起到減輕肺部炎癥的作用。

霧化吸入高滲鹽水治療膿毒癥肺損傷效果好，鑒于該方法在臨床已應(yīng)用于其他肺部疾病，安全性好且價(jià)格低廉，今后可在臨床推廣，以期為膿毒癥的治療提供更多有效方法。