槲皮素對大鼠廢用性骨質疏松的預防作用及ERK1/2-MAPK信號通路的影響

王 鵬，夏曉楓，左 斌，何精選，羅 斌，鄒 凱

缺乏機械負荷或機體運動障礙可能會造成骨骼結構和完整性的變化，導致嚴重的骨質流失廢用性骨質疏松癥[1-2]。宇航員在太空飛行期間1個月骨質丟失達到總骨量的2%，相當于絕經1年以上女性的骨質流失。既往文獻報道，由于下肢軸承重量的消除，多達10%的骨量可能會丟失[3-4]。廢用性骨質疏松癥相關的主要病理變化是骨孔增加和強度降低，導致骨折，引起機體功能惡化和病死率增加。越來越多的證據表明，骨形成的減少是廢用性骨質疏松癥發展的主要指標之一[5]。槲皮素是從蘆丁(蕓香甙)、槲皮甙、金絲桃甙中提取的主要生物活性黃酮類化合物，具有免受絕經后、糖皮質激素、維A酸、睪丸切除術和衰老引起骨質疏松癥的有益作用[6]。槲皮素體外實驗已被證明可有效增強成骨細胞的增殖和分化，增加成骨標志物如骨鈣素(OC)、骨橋蛋白(OPN)、骨保護素(OPG)和骨形態發生蛋白-2(BMP-2)的表達[7]。同時，槲皮素可以通過阻止核因子-κB(NF-κB)受體活化因子配體(RANKL)誘導的NF-κB和細胞外調節蛋白激酶(ERK)信號級聯激活以及破骨細胞基因標記的表達來消除破骨細胞生成和破骨細胞分化[8]。細胞外調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路在成骨調節中起重要作用[9]。本研究探討了槲皮素對大鼠廢用性骨質疏松的預防作用及對ERK1/2-MAPK信號通路的影響，旨在為廢用性骨質疏松癥的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 槲皮素(原料藥，純度95%，西安綠天生物技術有限公司，批號Q19057)；強骨膠囊(北京岐黃醫藥股份有限公司，規格0.25 g/粒，批號190817)；安息香酊、水合氯醛、化學發光試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號C0946、C17496、P0018S)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司，批號LK-00697)；ReverTra Ace qPCR R反轉錄試劑盒、SYBR?GreenRealtime PCR Master Mix試劑盒(上海達姆實業有限公司，批號FSQ-101、QPK201)；放射免疫沉淀緩沖液(上海遠慕生物科技有限公司，批號YM-S2014)；Nuclear Extract Kit試劑盒(上海艾躍生物科技有限公司，批號40010)；BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號PA1197)；聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膜(賽默飛世爾科技中國有限公司，批號SY55491)；ERK1/2、MAPK、β-actin一抗、辣根過氧化物酶綴合的二抗(安諾倫北京生物科技有限公司，批號P0655、P0742、PQ10339、SF-13556)；DXA-09型雙能X線發射儀、ImageQuant LAS 4000型化學發光成像分析儀(美國GE Healthcare公司)；西門子顯微CT機(德國西門子公司)；CFX384Touch型實時熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)。

1.2實驗動物及分組 選取清潔級SD大鼠80只，10～12周齡，體重230～270 g；湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。動物生產許可證號：SCXK(湘)2019-0003，動物使用許可證號：SYXK(湘)2019-0012，動物質量合格證號：2019L00173。隨機分為對照組、模型組、強骨膠囊組、槲皮素低、高劑量組，每組16只，自由攝取飼料、飲水，自動控制晝夜循環(12/12 h)，室溫(22±1)℃。

1.3動物建模及給藥 模型組、強骨膠囊組、槲皮素低、高劑量組建立大鼠廢用性骨質疏松模型：用70%異丙醇清潔大鼠尾部并涂上安息香酊連接到線束裝置上，線束裝置的另一端連接到籠子頂部的旋轉裝置，使大鼠的頭部向下傾斜30°夾角，防止大鼠的后肢在實驗期間的任何時間接觸地面，持續4周[12]。對照組無任何處理。從造模第1天開始，強骨膠囊組給予強骨膠囊250 mg/kg[10]灌胃，槲皮素低、高劑量組給予槲皮素100、200 mg/kg[11]灌胃，灌胃體積為10 ml/kg，1/d；對照組及模型組給予等體積生理鹽水，1/d；5組均給藥4周。

1.4股骨骨密度、骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分散度測定 在大鼠處死前1天，腹膜內注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠并在標本平臺上仰臥，使兩后肢分別取彎曲和伸展姿勢。通過雙能X線吸收測定法測量體內股骨遠端的骨密度。將大鼠股骨置于70%乙醇中，顯微CT機掃描股骨遠端松質骨，能量設置為500 mA和80 kV，分析骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分散度。

1.5股骨ERK1/2、MAPK mRNA水平測定 切下大鼠股骨，以液氮搗碎，并使用Trizol試劑從收獲的股骨渣中提取總RNA，采用ReverTra Ace qPCR RT試劑盒將反轉錄成cDNA。引物由碧云天生物技術研究所合成。引物序列如下：ERK1/2正向：5'-AGCCTTCGTTGCTGTGGAGA-3'，反向5'-TGGTGTCATAAGGATGGTGG-3'；MAPK正向 5'-AGGGTCCTACACATACTTCG-3'，反向5'-GGTCCTTGGTTAGCATTCTC-3'；β-actin正向 5'-CAAACTGCTAAATGACGAGG-3'，反向5'-GGGAAAGGTTGTGTAGGGTC-3'。使用SYBR?GreenRealtime PCR Master Mix試劑盒進行qRT-PCR分析，反應條件是94℃ 30 s，然后95℃，5 s和60℃，30 s；30個循環。2-ΔΔCt法計算ERK1/2、MAPK mRNA的相對表達水平，其中β-actin是內參基因。

1.6股骨ERK1/2、MAPK蛋白水平測定 將大鼠股骨在液氮中研磨，放射免疫沉淀緩沖液裂解蛋白質，使用Nuclear Extract Kit試劑盒提取核蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定分離的蛋白質濃度。SDS-PAGE電泳分離100 mg蛋白質，轉移至硝酸纖維素膜；在5%脫脂乳中封閉后，將膜與ERK1/2(1∶1000)、MAPK(1∶1000)、β-actin(1∶1000)一抗孵育，在4℃過夜。然后與辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5000)孵育2 h。增強的化學發光試劑盒顯示蛋白印跡，使用ImageQuant LAS 4000型化學發光成像分析儀成像。

2 結果

2.1股骨骨密度、骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分散度的比較 與對照組比較，模型組股骨骨密度、骨小梁數量、骨小梁厚度顯著降低，骨小梁分散度顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，強骨膠囊組、槲皮素低、高量組股骨骨密度、骨小梁數量、骨小梁厚度顯著升高，骨小梁分散度顯著降低(P<0.05)。與槲皮素低劑量組比較，強骨膠囊組和槲皮素高劑量組骨密度、骨小梁數量、骨小梁厚度升高，骨小梁分散度降低(P<0.05)。槲皮素高劑量組與強骨膠囊組股骨骨密度、骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分散度比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠股骨骨密度、骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分散度的比較

2.2股骨骨小梁結構及數量比較 對照組股骨骨小梁結構正常，數量較多，且相互連接成網狀結構；模型組股骨骨小梁結構疏松、數量較對照組明顯減少，且各骨小梁互相獨立、網狀結構減少；槲皮素低劑量組骨小梁結構較模型組變化不明顯；強骨膠囊組及槲皮素高劑量組骨小梁結構較模型組密集，數量增加，且網狀結構也增加。見圖1。

2.3股骨ERK1/2、MAPK mRNA表達水平比較 與對照組比較，模型組股骨ERK1/2 mRNA、MAPK mRNA表達顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，強骨膠囊組、槲皮素低、高劑量組股骨ERK1/2 mRNA、MAPK mRNA表達水平顯著降低，且槲皮素高劑量組與強骨膠囊組低于槲皮素低劑量組(P<0.05)。槲皮素高劑量組與強骨膠囊組股骨ERK1/2 mRNA、MAPK mRNA表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠股骨ERK1/2 mRNA和MAPK mRNA表達水平比較

2.4股骨ERK1/2、MAPK蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組股骨ERK1/2、MAPK蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，強骨膠囊組、槲皮素低、高劑量組股骨ERK1/2、MAPK蛋白表達水平降低，且槲皮素高劑量組和強骨膠囊組低于槲皮素低劑量組(P<0.05)。槲皮素高劑量組與強骨膠囊組股骨ERK1/2、MAPK 蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3、圖2。

圖2 5組大鼠股骨ERK1/2、MAPK蛋白印跡圖

表3 5組大鼠股骨ERK1/2、MAPK蛋白表達水平比較

3 討論

骨是通過有機基質礦化連續形成的更新組織。成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收平衡被破壞會導致骨質疏松癥等骨病。廢用性骨質疏松癥是一種常見的骨質疏松疾病。槲皮素在自然界中廣泛存在，是一種具有許多藥理活性的類黃酮；可消除自由基，抗病毒及保護心血管；還可預防過氧化氫誘導的成骨細胞功能障礙[13]。槲皮素是一種黃酮類化合物，可有效促進MC3T3-E1細胞的成骨細胞分化[14]，可抑制RAW264.7細胞中的破骨細胞生成。在動物骨質疏松實驗中，將大鼠切除卵巢60 d并給予不同劑量的槲皮素，結果表明槲皮素可以改善大鼠骨密度，逆轉海綿骨的微觀結構，提高生物力學性能；同時，槲皮素可以上調其成骨細胞并下調破骨細胞的能力[15]。本研究結果顯示，與模型組比較，強骨膠囊組、槲皮素低、高劑量組股骨骨密度、骨小梁數量、骨小梁厚度明顯升高，骨小梁分散度明顯降低；且槲皮素高劑量組和強骨膠囊組骨密度、骨小梁數量、骨小梁厚度高于槲皮素低劑量組，骨小梁分散度低于槲皮素低劑量組。模型組股骨骨小梁結構疏松、數量較對照組明顯減少，且各骨小梁互相獨立、網狀結構減少；強骨膠囊組及槲皮素高劑量組骨小梁結構較模型組密集，數量增加，且網狀結構也增加。這說明槲皮素能顯著改善骨小梁結構數量，增加骨密度，預防廢用性骨質疏松。

MAPK蛋白通過與受體復合物(Frizzled和LRP5/6)結合，導致細胞溶質復合物失活、β-連環蛋白降解。β-連環蛋白可以在細胞質中積累，然后易位到細胞核中，從而促進骨骼中特定基因的表達，最終導致成骨細胞分化減少并促進破骨細胞生成[16-17]。ERK1/2是骨和骨髓中最豐富的p38成員，并且在生理性骨穩態中具有重要作用。選擇性ERK1/2抑制劑可預防雌激素戒斷導致的骨質消耗[18]。有研究報道，與野生型同窩小鼠相比，由于機械刺激引起的骨形成增加在ERK1/2-MAPK信號激活的突變小鼠中消失，導致骨量減少；并且通過尾部懸浮機械卸載，降低了ERK1/2-MAPK蛋白信號傳導的活性[19]。槲皮素抑制ERK1/2-MAPK信號傳導對去卵巢小鼠骨質疏松有明顯改善作用[20]。本研究結果顯示，模型組股骨ERK1/2 mRNA和蛋白表達水平、MAPK mRNA和蛋白表達水平均高于對照組，且強骨膠囊組、槲皮素低、高劑量組低于模型組，且槲皮素高劑量組和強骨膠囊組低于槲皮素低劑量組。這與上述討論一致，提示槲皮素可抑制ERK1/2、MAPK mRNA和蛋白的表達，進而抑制ERK1/2-MAPK信號通路的傳導。

綜上所述，槲皮素能顯著改善骨小梁結構數量，增加骨密度，可預防廢用性骨質疏松；其機制與槲皮素可抑制ERK1/2、MAPK mRNA和蛋白的表達，進而抑制ERK1/2-MAPK信號通路的傳導有關。