抑郁癥肝郁脾虛證與SIRT1/PGC-1α通路的關聯性研究

李陽， 郭蓉娟， 于姚， 袁清潔， 郭建友

（1. 首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010；2. 北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078；3. 北京中醫藥大學，北京 100029；4. 清華大學玉泉醫院，北京 100040；5. 中國科學院心理研究所，北京 100101）

抑郁癥以其高患病率、高復發率、高致殘率和高自殺傾向的特點，已成為嚴重影響人類健康的世界性公共衛生問題。近年來，很多學者對抑郁癥中醫證候進行大樣本的流行病學研究，均得出類似的結論，證明了肝郁脾虛證是抑郁癥最常見的證型[1-2]。中醫脾為 “后天之本” 的角色與線粒體作為 “人體生命活動樞紐” 的認識高度吻合。有研究[3]發現，脾虛模型大鼠可出現心肌、肝、胃黏膜、骨骼肌和小腸細胞中線粒體含量減少，且形狀結構也存在異常。可見脾虛與線粒體能量代謝障礙密切相關，而線粒體能量代謝異常為抑郁癥肝郁脾虛的病機研究提供了新視角。SIRT1/PGC-1α 通路調控的線粒體生物合成是線粒體能量代謝的關鍵環節，對維持線粒體氧化磷酸化合成三磷酸腺苷（ATP）的能力具有至關重要的作用。探究抑郁癥肝郁脾虛證是否會出現SIRT1/PGC-1α通路的異常，對該證型的診斷研究和藥物治療靶點的研究均具有重要的意義。

1 對象與方法

1. 1研究對象選取2018年1月至2018年6月期間志愿參與本研究的合格受試者30 例，包括健康人（平和質）10 例，肝氣郁結型抑郁癥患者10 例，肝郁脾虛型抑郁癥患者10 例。在研究對象的選取過程中，凡符合納入標準的志愿者均對其詳細解釋說明研究方法并經其知情同意后方成為本研究的受試者。

1. 2診斷標準

1. 2. 1 抑郁癥診斷標準 參照《中國精神障礙分類和診斷標準》（CCMD-3）[4]中抑郁癥的診斷標準；漢密爾頓抑郁量表24 項（HAMD-24）評分≥8 分且＜35分的輕、中度抑郁癥患者。

1. 2. 2 中醫證候診斷標準 依據國家技術監督局1997 年頒布的《中醫臨床診療術語證候部分（GB/T16751.2-1997）》[5]中有關肝氣郁結證和肝郁脾虛證的診斷，并參照郭蓉娟等[6]發表的《抑郁癥中醫證候要素辨證量表研究》 一文中抑郁癥中醫證候要素辨證量表的證候要素進行相關證候的診斷。

1. 3納入標準

1. 3. 1 健康人組納入標準 ①HAMD-24 評分＜8 分；②18 歲≤年齡≤65 歲；③中醫體質量表判定為平和質；④自愿參加本研究并簽署知情同意書的受試者。

1. 3. 2 肝氣郁結型抑郁癥組納入標準 ①符合上述抑郁癥的診斷標準； ②符合肝氣郁結證的證候診斷標準；③20 分≤HAMD-24 評分≤35 分；④18歲≤年齡≤65歲；⑤自愿參加本研究并簽署知情同意書的患者。

1. 3. 3 肝郁脾虛型抑郁癥組納入標準 ①符合上述抑郁癥的診斷標準；②符合肝郁脾虛證的證候診斷標準；③20 分≤HAMD-24 評分≤35 分；④18歲≤年齡≤65歲；⑤自愿參加本研究并簽署知情同意書的患者。

1. 4排除標準①屬于雙相情感障礙和精神分裂癥的患者；②合并有嚴重的心臟病、腎病、神經病、腦血管病、肝病、出血性疾病、代謝性疾病以及肺功能障礙的患者；③存在線粒體疾病的患者；④存在意識障礙的患者。

1. 5研究方法納入研究的健康人和肝氣郁結型抑郁癥、肝郁脾虛型抑郁癥患者，于入組當天使用6 mL含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管采集靜脈血5 mL，靜置1 h；在3 000 r/min、25 ℃條件下離心10 min 后，分離血清，剩余液通過聚蔗糖—泛影葡胺密度梯度離心法分離提純外周血單個核細胞。以Western Blot 法檢測沉默信息調節因子1（SIRT1）、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子1α（PGC-1α）、核呼吸因子1（NRF-1）、核呼吸因子2（NRF-2）、線粒體轉錄因子A（TFAM） 蛋白表達含量。

1. 6統計方法采用SPSS 22.0統計軟件進行數據的統計分析。數據為連續性計量資料且符合正態分布者，以均數± 標準差（x ± s）表示，運用單因素方差分析。數據不符合正態分布者，采用中位數和四分位數間距[M（P25，P75）]描述，并運用非參數檢驗進行比較分析。對于計數資料，用率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 3組受試者的基本資料比較表1 結果顯示：3組受試者的年齡經非參數檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）；3 組受試者的性別經χ2檢驗，差異也無統計學意義（P＞0.05）。

表1 3組受試者的基本資料比較Table 1 Comparison of the baseline data of the three groups

2. 2 3組受試者的Western Blot檢測結果圖1 和圖2結果顯示：與健康人組相比，肝氣郁結型抑郁癥組患者的外周血SIRT1 蛋白表達量顯著升高（P＜0.05），肝郁脾虛型抑郁癥組患者的外周血SIRT1、PGC-1α、TFAM蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。

圖1 3組受試者的Western Blot結果Figure 1 Comparison of Western Blot results in the three groups

圖2 3組受試者的Western Blot條帶圖Figure 2 Comparison of Western Blot strap of the three groups

3 討論

10 號染色體上的沉默信息調節因子1（silent information regulator 1， SIRT1）是一種去乙酰化酶，它廣泛分布在哺乳動物的成熟組織，是典型的組蛋白脫乙酞酶（HDACs），也是目前sirtuins 家族研究最多的一個蛋白[7]。 SIRT1 可使FOXO、PGC-1α、PPAR-γ 和NF-κB 等核轉錄因子去乙酰化，在調節糖異生、糖酵解和脂肪β氧化，改善胰島素敏感性、線粒體損傷和炎癥等方面具有重要作用[8]。隨著研究的深入，人們發現SIRT1 通過脫乙酰化作用參與大腦正常的生理功能并且與神經精神疾病密切相關。SIRT1基因敲除或變異的小鼠產生了海馬基因表達變化、突觸可塑性缺失和樹突分支減少等表現[9]。Naoko A 等[10]的臨床研究發現，重度抑郁癥患者血細胞中SIRT1 mRNA水平是顯著下降的； Iacono L L 等[11]也發現小鼠出現的抑郁樣行為與大腦中SIRT1水平下降相關；王玥等[12]在研究中發現，應激抑郁大鼠SIRT1 mRNA表達量顯著低于對照組，提示抑郁可引起SIRT1的表達異常。SIRT1的表達降低，影響了其參與機體系統代謝，也減少了其保護作用。由此可見，眾多的研究提示SIRT1與抑郁癥密切相關，但是SIRT1功能缺失是如何誘發抑郁癥的，其中的病理機制并不明確。PGC-1α 是SIRT1 下游的一個主要靶基因，廣泛參與線粒體生物合成等多條代謝途徑[13]，被視為控制線粒體功能及能量的動態平衡的效應器[14]。當細胞能量儲存減少，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）水平升高，則會激活SIRT1，進而去乙酰化PGC-1α 而促進ATP 的產生[15]。PGC-1α 特異性的表達于能量需求高并富含線粒體的組織，如骨骼肌、脂肪、心、肝及腎臟等，在寒冷、禁食、運動等能量限制狀態下表達增加，不僅可以促進線粒體的生物合成，且能與PPARγ 相互作用，調節適應性產熱[16]。且PGC-1α是線粒體生物源與呼吸的有效刺激物，是大多數細胞線粒體電子傳遞鏈中活性氧的主要生產者，可以防止由神經細胞與氧化應激因子引起的死亡[17]。線粒體在促進機體適應性產熱、呼吸系統表達的同時需要依賴核線粒體基因。Guqneja S 等[18]發現了線粒體基因編碼的2 個重要因子，即NRF-1 和NRF-2。NRF-1 作用于線粒體血紅素合成相關基因和線粒體蛋白轉運基因，對于核基因和線粒體基因的表達具有輔助調控作用。NRF-2 異源二聚體可與許多核編碼線粒體蛋白基因的啟動子序列結合，有些基因還包含NRF-1 的結合位點。NRF-1 和NRF-2 在呼吸亞基的表達和線粒體轉錄因子表達方面發揮著重要作用。Puigserver P 等[19]證明，PGC-1α是NRF系統的重要效應物，它可上調NRF-1 和NRF-2。線粒體轉錄因子A（TFAM）是由核基因編碼的一種小分子多肽，能激活及調節線粒體轉錄及復制，并在氧化應激中起著重要作用[20]。它通過包裹細胞內線粒體DNA（mtDNA）形成類似組蛋白的核樣結構[21]，維護其完整和穩定，使其免受氧化應激（OS）損傷[22]；同時，通過促進mtDNA 的復制來調節其拷貝數，這是TFAM 保護線粒體功能的基礎[23]。

本研究發現，與健康人群相比，肝氣郁結型抑郁癥組患者外周血SIRT1 含量明顯升高（P＜0.05），而PGC-1α、NRF-1、NRF-2、TFAM 含量存在上升趨勢（P＞0.05），說明肝氣郁結型抑郁癥患者SIRT1/PGC-1α 信號通路的活性可能被上調。因為肝氣郁結多處于抑郁癥發展過程的早期，此時機體需要更多的能量以抵抗應激反應，所以這可能是線粒體的合成和呼吸作用被加強的原因。從中醫角度來講，肝氣郁結證處于氣機郁滯的狀態，多由肝主疏泄的功能異常導致，此時正氣并未虧虛，而肝為剛臟，具有剛強躁急的生理特性，故肝氣郁結時則表現出情緒焦慮抑郁、胸脅脹滿不舒等一系列機體高動力表現，也同樣印證了為何線粒體的合成和呼吸作用被加強。反觀肝郁脾虛型抑郁癥患者， 外周血SIRT1、 PGC- 1α、TFAM 蛋白表達含量均明顯降低（P＜0.05），而NRF-1、NRF-2 含量存在下降趨勢（P＞0.05），說明肝郁脾虛型抑郁癥患者SIRT1/PGC-1α信號通路的活性可能被抑制。因為肝郁脾虛多處于抑郁癥發展過程的中后期，此時機體在經過長時間的外界事件刺激后導致神經、內分泌、免疫等多個系統的失調，形成機體從情緒異常到機體機能紊亂的過渡，在此過程中產生的氧化應激或炎癥反應等可通過破壞線粒體內膜、損傷mtDNA、下調PGC- 1α 等形式損傷機體各部位的線粒體功能[24-28]，故機體出現情緒低落、興趣缺乏、極度疲乏、思維遲緩、食欲減退、腹瀉等中樞及外周的多系統低動力癥狀，這可能是線粒體的合成和呼吸作用被減弱的原因及結果。從中醫角度來講，肝失疏泄日久導致肝失條達或氣郁日久化火，均可進一步導致肝氣（火）橫逆犯脾，而脾主運化，脾氣虛弱則不能運化水谷，故出現食欲減退；脾虛易被濕困，故出現便溏不爽；脾主升清，將水谷精微上輸于心、腦等以榮養之，脾虛不能升清，故出現情緒低落、興趣缺乏等大腦能量低下癥狀；脾主肌肉，氣虛則致肌肉疲乏無力，故肝郁脾虛時表現出機體功能全面低下的狀態，與線粒體的合成和呼吸作用被抑制的多系統低動力癥狀表現趨于一致。

總之，肝郁脾虛型抑郁癥患者存在線粒體能量代謝及生物合成功能的障礙，這可能是其多系統低動力癥狀的病理機制之一，SIRT1/PGC-1α 通路介導的線粒體能量代謝及生物合成異常也可能是抑郁癥肝郁脾虛證的生物學實質之一，這為未來進一步探究抑郁癥肝郁脾虛證的生物學診斷及藥物作用靶點提供了重要借鑒。