芪丹顆粒對2型糖尿病患者胰島素抵抗及血清CTRP6和CTRP12水平的影響

熊思明， 葉仁群

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬寶安中醫(yī)院，廣東深圳 518133；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣東廣州 510405）

作為世界性公共衛(wèi)生疾病，糖尿病對人體健康的危害不言而喻。由超重和肥胖逐漸演變?yōu)樘悄虿。葝u素抵抗在其中發(fā)揮了不容忽視的影響。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)普遍認為肥胖誘導(dǎo)的脂肪組織巨噬細胞浸潤的慢性低度炎癥及代謝性炎癥綜合征與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展存在著因果關(guān)系[1-3]。而Kwon H等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪組織中脂肪細胞分泌的大量脂肪因子可作用于機體炎癥反應(yīng)環(huán)節(jié)并影響胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展，如以脂聯(lián)素、血清分泌型卷曲相關(guān)蛋白5、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4 等為代表的抗炎脂肪因子及以瘦素、抵抗素、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等為代表的促炎脂肪因子，分別在機體內(nèi)發(fā)揮著抑制/促進炎癥刺激、提高/降低胰島素敏感性、改善/誘導(dǎo)或加重胰島素抵抗、抵抗/增進肥胖發(fā)生的作用。聚焦于炎癥學(xué)說，脂肪組織的慢性低度炎癥的解決可能是治療胰島素抵抗及肥胖引起的代謝功能障礙的一種方法。

CTRP6和CTRP12屬于新近發(fā)現(xiàn)的與脂聯(lián)素具有結(jié)構(gòu)同源性的脂肪因子超家族補體C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白（complement- C1q/TNF- related protein，CTRP）家族。研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，CTRP6具有促進脂質(zhì)沉積和肥胖發(fā)生、拮抗胰島素信號等作用，而CTRP12則低表達于肥胖和糖尿病患者，具有降低血糖、抗炎、促進脂肪細胞攝取葡萄糖、抵抗肥胖、胰島素增敏等作用。本課題組的前期研究證實了芪丹顆粒可通過影響脂聯(lián)素、抵抗素等抗炎/促炎脂肪因子的水平來改善2 型糖尿病患者的胰島素抵抗[8]。結(jié)合前期研究結(jié)果，本研究旨在進一步探討芪丹顆粒對2型糖尿病脾虛痰瘀證患者胰島素抵抗及新型脂肪因子CTRP6和CTRP12的影響，并探討胰島素抵抗與CTRP6及CTRP12的關(guān)系，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1. 1研究對象及分組選取2019年1月至2019年12 月于深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院內(nèi)分泌科門診及住院部接受治療的符合納入標準并簽署知情同意書的2 型糖尿病脾虛痰瘀證患者，共60 例，其中男33 例，女27 例；年齡30 ～60 歲，平均（50.77 ±6.98）歲；病程1.8 ～15.9 年，平均（6.92 ± 3.64）年。按患者就診先后順序，采用隨機數(shù)表將患者隨機分為治療組和對照組，每組各30例。

1. 2診斷標準西醫(yī)診斷標準：參考1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的2型糖尿病診斷標準[9]。中醫(yī)診斷標準：參考中華中醫(yī)藥學(xué)會《糖尿病中醫(yī)防治指南》[10]關(guān)于消渴病的中醫(yī)診斷標準，并根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[11]及《糖尿病中醫(yī)診療標準》[12]擬定脾虛痰瘀證的辨證標準：嗜食肥甘厚味，形體肥胖，頭身困重，胸悶脘脹，肢體麻木，惡心口黏，神倦懶言，氣短乏力，口干不欲飲，舌質(zhì)淡暗，苔白厚膩，有瘀點瘀斑，脈沉滑或沉澀。

1. 3納入標準①符合上述中西醫(yī)診斷標準；②中醫(yī)證型為脾虛痰瘀證；③年齡介于30～60 歲之間；④自愿參加本研究并簽署知情同意書的患者。

1. 4排除標準①非2 型糖尿病患者；②糖尿病急性并發(fā)癥發(fā)病1個月內(nèi)，或伴有嚴重的糖尿病慢性并發(fā)癥患者；③合并有嚴重感染或其他系統(tǒng)嚴重原發(fā)性疾病患者；④精神病患者；⑤過敏體質(zhì)或?qū)Ρ狙芯克盟幬镞^敏的患者；⑥妊娠期及哺乳期婦女；⑦依從性差，未按規(guī)定進行治療，或自行加用其他有治療作用的藥物，從而影響療效判定的患者。

1. 5治療方法所有患者均給予糖尿病基礎(chǔ)治療，包括糖尿病飲食、運動鍛煉和限煙戒酒等健康知識教育。在此基礎(chǔ)上，對照組給予口服鹽酸二甲雙胍片（商品名：格華止，中美上海施貴寶制藥有限公司，批準文號：國藥準字H200223370）治療，每天2次，每次0.5 g，飯后口服；治療組給予口服芪丹顆粒（以黃芪、丹參、三七、山楂等4 味中藥組方而成，由深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院制劑室制備，劑型、規(guī)格及制作方法參考文獻[8]）治療，每次1 袋，每天2 次，于早晚飯前用200 mL 開水沖服。連續(xù)治療8周后評價療效。

1. 6觀察指標2 組患者治療前后以下指標各檢測1 次。①胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）評估：HOMA-IR=空腹血糖（FPG）×空腹胰島素（FINS）/22.5；②血清CTRP6、CTRP12 水平測定：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定，試劑盒由上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn)（編號：JLMB12692、JLMB13388）。

1. 7安全性評價2 組患者治療前后均檢測基本生命體征（包括體溫、呼吸、心率、脈搏、血壓等）以及血常規(guī)、尿常規(guī)、大便常規(guī)、肝功能、腎功能和心電圖等；研究過程中如出現(xiàn)不良反應(yīng)，應(yīng)詳細記錄其不良反應(yīng)情況及相應(yīng)的處理措施。

1. 8統(tǒng)計方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)± 標準差（x±s）表示，組內(nèi)治療前后比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示， 組間比較采用χ2檢驗； HOMA- IR、CTRP6、CTRP12之間分別進行Pearson相關(guān)及多元線性逐步回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 2組2型糖尿病患者基線資料比較治療組30例患者中，男17例，女13例；年齡32 ～60歲，平均年齡（51.59 ± 6.68）歲；病程2.3 ～14.6 年，平均病程（6.73 ± 3.32）年。對照組30 例患者中，男16 例，女14 例；年齡30 ～59 歲，平均年齡（49.93± 7.38）歲；病程1.8 ～15.9 年，平均病程（7.07 ±4.02）年。2組患者的性別、年齡、病程等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2. 2 2組2型糖尿病患者治療前后HOMA-IR比較表1 結(jié)果顯示： 治療前， 2 組患者的HOMA-IR 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，2組患者的HOMA-IR 均較治療前明顯下降（P＜0.05），且治療組對HOMA-IR 的下降作用明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 2組2型糖尿病患者治療前后HOMA-IR比較Table 1 Comparison of HOMA-IR in type 2 diabetic patients of the two groups before and after treatment （ ± s）

表1 2組2型糖尿病患者治療前后HOMA-IR比較Table 1 Comparison of HOMA-IR in type 2 diabetic patients of the two groups before and after treatment （ ± s）

①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.05，與對照組治療后比較

組別治療組對照組N/例30 30治療前6.08 ± 1.15 6.31 ± 1.05治療后3.57 ± 0.86①②4.24 ± 0.73①

2. 3 2組2型糖尿病患者治療前后血清CTRP6、CTRP12水平比較表2結(jié)果顯示：治療前，2組患者血清CTRP6、CTRP12 水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 治療后， 治療組患者血清CTRP6 水平較治療前明顯下降（P＜0.05），血清CTRP12水平較治療前明顯升高（P＜0.05）；而對照組治療前后血清CTRP6和CTRP12水平均無顯著性變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。組間比較，治療組對血清CTRP6 水平的下降作用和對血清CTRP12水平的升高作用均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 2組2型糖尿病患者治療前后血清CTRP6、CTRP12水平比較Table 2 Comparison of serum CTRP6 and CTRP12levels in type 2 diabetic patients of the two groups before and after treatment （x ± s）

2. 4 HOMA-IR與血清CTRP6、CTRP12水平的Pearson相關(guān)性分析經(jīng)HOMA-IR 的Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HOMA-IR與血清CTRP6水平呈正相關(guān)（r= 0.746，R2= 0.557，P＜0.01）， 與 血 清CTRP12水平呈負相關(guān)（r= -0.802，R2= 0.644，P＜0.01）。結(jié)果見表3和圖1。

表3 HOMA-IR與血清CTRP6、CTRP12水平的Pearson相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation analysis of HOMA-IR with serum CTRP6 and CTRP12 level in type 2 diabetic patients of the two groups

圖1 HOMA-IR 與血清CTRP6和CTRP12的Pearson相關(guān)性分析Figure 1 Pearson correlation analysis of HOMA-IR with serum CTRP6 and CTRP12 level in type 2 diabetic patients of the two groups

2. 5血清CTRP6與CTRP12水平的Pearson相關(guān)性分析經(jīng)CTRP6 的Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清CTRP6 與CTRP12 水平呈負相關(guān)（r= -0.577，R2=0.333，P＜0.01），結(jié)果見圖2。

圖2 血清CTRP6與CTRP12的Pearson相關(guān)性分析Figure 2 Pearson correlation analysis of serum CTRP6 with serum CTRP12 level in type 2 diabetic patients of the two groups

2. 6 HOMA-IR的多元線性逐步回歸分析為明確HOMA-IR 的獨立相關(guān)因素，本研究進一步以HOMA-IR 為因變量，以年齡、性別、病程、血清CTRP6、CTRP12 水平為自變量，進行多元線性逐步回歸分析。 結(jié)果（表4）顯示， 血清CTRP6、CTRP12 水平是HOMA-IR 的獨立影響因子（P＜0.01）。

表4 HOMA-IR的多元線性逐步回歸分析Table 4 Multiple stepwise regression analysis of HOMA-IR with serum CTRP6 and CTRP12 level in type 2 diabetic patients of the two groups

2. 7 2組患者不良反應(yīng)情況研究過程中，2組患者的基本生命體征，血、尿、大便常規(guī)，肝、腎功能及心電圖等安全性指標均無異常改變。治療結(jié)束后2 周，對2 組患者進行藥物不良反應(yīng)追蹤，2組均未發(fā)現(xiàn)與本次試驗藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。

3 討論

作為2型糖尿病的病理生理特征，胰島素抵抗的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及脂質(zhì)超載和炎癥反應(yīng)兩大方面，涵蓋了整個胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。越來越多的研究證實，脂肪組織分泌的脂肪因子參與了機體糖脂代謝、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等生理和病理過程并通過其分泌失衡干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響機體胰島素抵抗、肥胖相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展趨勢。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過大量體外細胞、動物實驗及臨床研究認可了脂聯(lián)素等抗炎脂肪因子以及瘦素、抵抗素、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等促炎脂肪因子在胰島素抵抗、肥胖病、2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、代謝綜合征等內(nèi)分泌代謝性疾病發(fā)病機制中發(fā)揮的作用[13]。作為新型脂肪因子，CTPRs與脂聯(lián)素具有結(jié)構(gòu)同源性，其多個家族成員被證實具有抗糖尿病、胰島素增敏作用[5]。結(jié)合其生理病理作用及影響糖脂代謝、炎癥調(diào)節(jié)等相關(guān)機制研究，推測CTPRs可能為治療胰島素抵抗、肥胖相關(guān)性疾病的潛在新途徑。

作為CTRPs 中相對獨特的一個成員，CTRP6具有促進脂質(zhì)沉積和肥胖發(fā)生、拮抗胰島素信號等作用，在糖脂代謝過程、炎癥調(diào)節(jié)、胰島素抵抗和肥胖的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[6]。Lei X等[14]在體外動物細胞實驗中，通過模擬糖尿病狀態(tài)建立的3T3-L1脂肪細胞模型，證實CTRP6高表達于糖尿病狀態(tài)小鼠體內(nèi)，而CTRP6 高表達的非糖尿病狀態(tài)小鼠體內(nèi)的胰島素釋放則減少；同時CTRP6 還可通過自分泌方式刺激靶向巨噬細胞的極化過程，進而劑量依賴性地上調(diào)促炎細胞因子（如TNF-α）的表達來調(diào)節(jié)局部炎癥，并通過旁分泌方式作用于脂肪細胞，進而減少胰島素刺激的Akt磷酸化以拮抗胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。上述兩種方式均促進并加劇了脂肪細胞內(nèi)的慢性低度炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致脂肪細胞胰島素敏感性降低，逐步介導(dǎo)胰島素抵抗產(chǎn)生。同時研究還表明CTRP6 可直接影響小鼠的胰島素敏感性，相反，CTRP6 的缺乏則降低了脂肪組織中的循環(huán)炎性細胞因子和促炎性巨噬細胞水平，并增強了脂肪組織中胰島素刺激的Akt活化[14]。Wang M等[15]通過對比健康人、糖耐量受損（IGT）患者及2 型糖尿病患者的相關(guān)糖脂代謝指標及部分脂肪因子水平，發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病患者血清CTRP6 水平最高，IGT 患者次之，健康人最低；同時發(fā)現(xiàn)機體血清CTRP6 水平與血糖血脂相關(guān)指標、胰島素水平、肥胖相關(guān)指標和相關(guān)炎癥因子水平呈正相關(guān)，且在糖耐量試驗（OGTT）中血清CTRP6水平變化與血糖、胰島素和TNF-α的水平變化趨勢一致。

相反，同為CTRPs 中的一員，擁有與脂聯(lián)素20%結(jié)構(gòu)同源性的CTRP12 則具有降低血糖、抗炎、促進脂肪細胞攝取葡萄糖、抵抗肥胖、胰島素增敏等作用，且其分泌受制于胰島素的調(diào)節(jié)[7]。Wei Z 等[16]通過體外動物實驗證實CTRP12 可以通過兩種方式來改善胰島素抵抗：一是通過胰島素依賴性方式，直接增強肝臟和脂肪組織的胰島素敏感性來改善胰島素抵抗；二是通過胰島素非依賴性方式，直接激活胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的經(jīng)典途徑PI3K-Akt 信號通路，降低肝臟細胞G-6-Pase和PEPCK 的表達來抑制肝糖異生并促進脂肪細胞攝取葡萄糖，增強肝臟和脂肪組織中的胰島素信號以達到改善胰島素抵抗的目的。 Enomoto T等[17-18]先后通過體外動物細胞實驗發(fā)現(xiàn)CTRP12 可劑量依賴性地抑制巨噬細胞中促炎性介質(zhì)（如TNF-α、IL-1β 和MCP-1）的基因表達，減輕脂肪組織中的炎癥刺激，提示CTRP12 具有抗炎作用；而暴露于促炎環(huán)境和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的3T3-L1 脂肪細胞則會下調(diào)CTRP12表達，提示在脂肪組織功能障礙的病理條件下CTRP12水平會下降；此外，使用特異性c-Jun 氨基末端激酶（JNK）抑制劑處理培養(yǎng)的3T3-L1 脂肪細胞則發(fā)現(xiàn)，JNK 抑制劑可以阻斷TNF-α對脂肪組織表達CTRP12的抑制作用，表明TNF-α可通過刺激活化JNK途徑來抑制CTRP12表達。還有Tan B K 等[19-21]先后通過臨床試驗及體外細胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，在健康人中高胰島素血癥可誘導(dǎo)CTRP12分泌和表達，而服用二甲雙胍治療的多囊卵巢綜合征（PCOS）患者血清CTRP12 水平較服用前上升，且羅格列酮可以顯著增加脂肪組織中CTRP12的分泌和表達。

基于胰島素抵抗是2 型糖尿病的病理生理特征，二者均可歸屬于祖國醫(yī)學(xué) “消渴”“消癉”“肥胖” 等疾病范疇。段軍等[22]認為 “郁、熱、虛、損” 是消渴發(fā)病的病機關(guān)鍵，正如《素問·奇病論》云：“此肥美之所發(fā)也，此人必數(shù)食甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴。” 飲食不節(jié)，積滯中焦，久則化熱內(nèi)聚，蒸灼津液，煉津為痰；脾胃受損，運化失職，氣機升降失常，血行不暢，則氣滯血瘀；痰濁血瘀互結(jié)，日久機體逐漸形成脾虛為主導(dǎo)、痰瘀互結(jié)為輔的局面，主輔聯(lián)動，共同催化胰島素抵抗的產(chǎn)生。其中，痰瘀互結(jié)是2型糖尿病胰島素抵抗產(chǎn)生的關(guān)鍵因素[23]。當(dāng)前大量中藥藥理研究發(fā)現(xiàn)多種單味中藥具有降血糖、抗炎、胰島素增敏、改善胰島素抵抗的作用[24]，如黃芪多糖可降低2型糖尿病大鼠血糖水平，增加組織對胰島素的敏感性，改善胰島素受體和受體后環(huán)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[25]；鐘振東等[26]的動物實驗證實三七總皂苷通過提高KK-Ay 鼠對胰島素和瘦素的敏感性，發(fā)揮抗高血糖、抗肥胖作用；蔡雙朋等[27]研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅰ可通過抑制PTP1B 的表達來促進P-AKT/AKT 信號通路活化，進而改善胰島素抵抗HepG2 細胞；吳淑艷等[28]通過建立高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠模型，發(fā)現(xiàn)山楂中的熊果酸可以降低胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），升高胰島素敏感指數(shù)。針對上述病因病機，結(jié)合現(xiàn)代中藥藥理研究，本課題組采用以黃芪、丹參、三七、山楂等4味中藥組方而成的芪丹顆粒來治療脾虛痰瘀型2型糖尿病，意在發(fā)揮其組方中藥的健脾化痰、袪瘀通絡(luò)之功效來改善2型糖尿病患者的胰島素抵抗。

本研究結(jié)果表明，芪丹顆粒可明顯降低2型糖尿病患者HOMA-IR及血清CTRP6水平，上調(diào)血清CTRP12水平，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進一步通過Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病患者HOMA-IR 與血清CTRP6 水平呈正相關(guān)，而與血清CTRP12 水平呈負相關(guān)，血清CTRP6 水平與血清CTRP12 水平成負相關(guān)，這與Wang M 等[15]的研究結(jié)論一致；同時經(jīng)多元線性逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)，血清CTRP6 和CTRP12 水平是HOMA- IR 的獨立影響因素。 綜上， CTRP6 和CTRP12共同參與機體糖脂代謝過程，研究結(jié)果提示二者可能通過自身血清水平變化，一方面減輕脂肪組織存在的炎癥刺激，另一方面活化PI3KAkt胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來增加胰島素敏感性，共同達到減輕2型糖尿病胰島素抵抗的目的。本研究結(jié)果與本課題組前期研究中芪丹顆粒可能作用于脂肪-胰島內(nèi)分泌軸，通過調(diào)節(jié)與胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展相關(guān)的脂肪因子的合成及分泌來改善胰島素抵抗的結(jié)論相呼應(yīng)[8]。