表兒茶素抑制HMGB1信號通路修復心肌細胞缺氧/復氧損傷

俞超楠

（浙江中醫藥大學，浙江杭州 310053）

缺血組織恢復血液灌注后組織損傷反而加重，甚至發生不可逆損傷的現象為缺血再灌注損傷[1]。心肌缺血再灌注損傷往往會導致心肌梗死面積擴大，心功能下降，最終導致心力衰竭[2]。缺血再灌注損傷是一種復雜的病理生理過程，其發生機制與氧自由基產生、鈣超載、線粒體損傷、能量代謝異常、炎癥反應等相關[1，3]。研究發現，高遷移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）介導的相關途徑HMGB1/Toll 樣受體4（Toll-like receptors 4， TLR4）/核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號通路參與了心肌缺血再灌注損傷的發生機制[4]。

表兒茶素[（-）-epicatechin]是多種植物、食品及中藥材中的重要活性成分之一，是具有類黃酮結構的兒茶素類化合物，其生理活性包括抗氧化、抗炎、降糖降脂等[5]。有研究[6]報道，表兒茶素對缺氧處理后小鼠心肌缺血損傷具有一定的保護作用。因此，表兒茶素在缺血再灌注損傷中對心臟的保護作用引起了人們的關注[7]，但其作用機制并未闡述完全。本研究通過構建心肌細胞缺氧/復氧（hepoxia/reoxygenation，H/R）模型模擬動物心肌缺血再灌注損傷[8]，探究表兒茶素是否通過調控HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路對H/R 細胞損傷產生修復作用，以期為心肌缺血再灌注的治療提供新方向，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1細胞及培養大鼠心肌細胞H9C2 購自中國科學院細胞庫。細胞復蘇后培養于含體積分數10%胎牛血清的DMEM 中，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱內培養。

1. 2藥物與試劑表兒茶素（美國Sigma公司，貨號：E4081），純度≥98%。HMGB1抑制劑（Glycyrrhizin）（美國Selleck 公司）；DMEM（美國Hyclone 公司）；胎牛血清（美國Gibco 公司）；細胞計數試劑盒8（CCK8）、兔抗HMGB1 抗體、兔抗TLR4 抗體、兔抗 磷 酸 化NF- κB（p-NF- κB）p65 抗 體、 兔 抗NF-κB p65抗體、兔抗GAPDH抗體（武漢Bioswamp公司）；逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）；SYBR Green PCR 試劑盒（美國KAPA Biosystems 公司）；化學發光試劑（美國Millipore公司）。

1. 3主要儀器厭氧發生裝置（日本三菱瓦斯化學株式會）；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；酶標儀（美國Thermo公司）；流式細胞儀（美國ACEA公司）；熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；全自動化學發光分析儀（上海天能公司）。

1. 4 H/R損傷細胞模型構建收集對數生長期的H9C2 細胞，調整細胞密度后分裝于6 孔板中，每孔2 mL，約1 × 106個細胞/孔，于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱內培養過夜。再將細胞轉移至不含血清的低糖低氧DMEM 中，在含體積分數94%N2、5% CO2和1% O2的培養箱中作用6 h，溫度為37 ℃。后用新鮮完全培養基于常氧狀態培養6 h。在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態。

1. 5細胞分組與處理收集對數生長期H9C2 細胞，分布于6 孔板中，約1 × 106個細胞/孔。將細胞分為對照組、模型組、表兒茶素組、HMGB1 抑制劑組等4組。對照組：正常細胞；模型組：構建H/R 細胞模型；表兒茶素組：構建H/R 細胞模型，在細胞造模前30 min 加入終濃度為20 μmol/L 的表兒茶素溶液[磷酸鹽緩沖液（PBS）為溶劑[9]]；HMGB1抑制劑組：構建H/R 細胞模型，于細胞造模前30 min，加入終濃度為100 μg/mL 的HMGB1 抑制劑Glycyrrhizin[10]。

1. 6 CCK8法測定細胞增殖能力收集H9C2 細胞，調整細胞密度后分裝于96孔板中，每孔180 μL，約5 × 103個細胞/孔，于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱內培養過夜，待細胞貼壁。按照上述分組處理細胞，分別于12、24、48、72 h 時取出細胞培養板，每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續培養4 h。應用酶標儀于波長450 nm處檢測各孔的吸光值。

1. 7 AnnexinV-FITC/碘化丙啶（PI）雙染法測定細胞凋亡情況模型構建后24 h，H9C2 細胞經消化處理后收集于離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞并計數。取約5 × 105個細胞，以1 000 r/min 離心5 min，棄上清。預冷PBS 重懸細胞沉淀，以1 000 r/min 離心5 min，棄上清。加入200 μL Binding buffer 懸浮細胞，再加入10 μL AnnexinV-FITC 和10 μL PI，混勻后，4 ℃避光孵育30 min。加入300 μL Binding buffer，流式細胞儀上機檢測，以NovoExpressTM軟件進行分析。

1.8實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測細胞HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA的表達收集各組H9C2 細胞，TRIzol 提取RNA，反轉錄合成cDNA，進行PCR 擴增，擴增體系為SYBR Green Mix（10 μL）、上游引物（0.5 μL）、下游引物（0.5 μL）、cDNA 模板（1 μL）、ddH2O（8 μL），共20 μL。反應條件：95 ℃，30 min；95 ℃，5 s；56 ℃，10 s；72 ℃，25 s。共39個循環。PCR引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，引物序列如下。HMGB1 上游引物為5’-ATCCATTGGTGATGTTGC-3’，下游引物為5’-TCTTTTCATAGGGCTGCT-3’，擴增長度80 bp。TLR4 上游引物為5’-ATCCCTTA TTCAACCA-3’，下游引物為TGTCTCCACAGCCA CC-3’，擴增長度255 bp。NF-κB p65 上游引物為5’- TGTTTCCCCTCATCTTTCC- 3’， 下 游引 物 為5’-GTGGTATCTGTGCTTCTCTCC-3’，擴增長度為154 bp。GAPDH 上游引物為5’-CAAGTTCAACGG CACAG-3’，下游引物為5’-CCAGTAGACTCCAC GACAT-3’，擴增長度138 bp。采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。

1. 9蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測細胞HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白的表達提取各組細胞蛋白，定量后以20 μg蛋白上樣量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離。采用濕轉法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，并用50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉2 h。將膜放入濕盒中，加入一抗[HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65，稀釋比為1∶1 000；GAPDH，稀釋比為1∶2 000]，室溫孵育1 h。PBST 洗膜，加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。PBST洗膜，滴加化學發光試劑，與膜充分接觸后，置于全自動化學發光分析儀中檢測，讀取條帶灰度值。

1. 10統計方法采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數± 標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 H/R損傷心肌細胞模型形態學表現圖1 結果顯示：對照組H9C2細胞生長狀態良好，大部分細胞呈梭形或不規則星形，貼壁生長，排列緊密，而H/R 模型組細胞間距較大，細胞變圓，皺縮，近30%的細胞呈圓形漂浮于培養液上，呈現出明顯的凋亡特征。

圖1 H/R損傷H9C2細胞形態（×200）Figure 1 Morphological features of H/R injury H9C2 cells（×200）

2. 2表兒茶素對H/R損傷心肌細胞增殖的影響圖2結果顯示，H/R模型組細胞增殖能力較對照組顯著降低（P＜0.05），而與H/R 模型組比較，表兒茶素組、 HMGB1 抑制劑組細胞增殖能力升高（P＜0.05）。表明表兒茶素、HMGB1抑制劑處理可使H/R細胞增殖能力得到恢復。

圖2 表兒茶素對H/R損傷心肌細胞增殖的影響Figure 2 Effects of（-）-Epicatechin on the proliferation of H/R injury H9C2 cells

2. 3表兒茶素對H/R損傷心肌細胞凋亡的影響圖3結果顯示：與對照組比較，H/R模型組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與H/R 模型組比較，表兒茶素組和HMGB1 抑制劑組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

圖3 表兒茶素對H/R損傷心肌細胞凋亡的影響Figure 3 Effects of（-）-Epicatechin on the apoptosis of H/R injury H9C2 cells

2. 4表兒茶素對H/R損傷心肌細胞HMGB1、TLR4及NF-κB p65 mRNA表達的影響圖4 結果顯示：與對照組比較，H/R 模型組細胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA 表達水平均明顯升高（P＜0.05）；而與H/R 模型組比較，表兒茶素組和HMGB1 抑 制 劑 組HMGB1、 TLR4 及NF- κB p65 mRNA表達水平均降低（P＜0.05）。

2. 5表兒茶素對H/R損傷心肌細胞HMGB1、TLR4蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值的影響圖5結果顯示：與對照組比較，H/R模型組細胞HMGB1、 TLR4 蛋白表達水平及p- NF- κB p65/NF-κB p65 比值均明顯升高（P＜0.05）；而與H/R 模型組比較，表兒茶素組和HMGB1 抑制劑組HMGB1、 TLR4 蛋白表 達 水 平 及p-NF- κB p65/NF-κB p65比值均降低（P＜0.05）。

圖4 表兒茶素對H/R損傷心肌細胞HMGB1、TLR4及NF-κB p65 mRNA表達的影響Figure 4 Effects of（-）-Epicatechin on the mRNA expression levels of HMGB1，TLR4 and NF-κB p65 of H/R injury H9C2 cells

圖5 表兒茶素對H/R損傷心肌細胞HMGB1、TLR4蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值的影響Figure 5 Effects of（-）-Epicatechin on the protein expression levels of HMGB1，TLR4 and ratio of p-NF-κB p65/NF-κB p65 of H/R injury H9C2 cells

3 討論

急性心肌梗死是世界上發病率及死亡率最高的疾病之一[11]。目前，急性ST 段抬高心肌梗死的臨床標準治療方法是再灌注策略，可改善急性冠脈綜合征[12]。然而，再灌注本身是一把 “雙刃劍”，在改善梗死相關冠狀動脈通暢性的同時，以時間依賴的方式積累產生再灌注相關的病理癥狀[13]。再灌注引起的病理變化，包括氧化應激、炎癥反應、細胞內鈣超載，引起細胞凋亡和壞死，最終導致不可逆轉的細胞死亡。再灌注引起的心律失常和心肌頓抑為可逆的，而微血管阻塞和致死性心肌再灌注損傷為不可逆的[14]。

再灌注損傷涉及到氧自由基產生、炎性介質釋放以及細胞凋亡等一系列病理反應。機體內炎癥反應的激活，將造成心肌進一步的損傷，使心肌細胞凋亡加劇，心肌梗死面積擴大[15]。本研究結果顯示，H/R損傷心肌細胞增殖能力減弱，而凋亡率升高，經過表兒茶素或是HMGB1抑制劑提前處理后，細胞增殖能力得到一定的恢復，凋亡率降低，表明表兒茶素與HMGB1 對H/R 損傷心肌細胞具有相似的修復作用，可促進心肌細胞增殖，抑制凋亡。

HMGB1是一種非組蛋白DNA結合蛋白，壞死的心肌細胞在缺血環境中會被動釋放HMGB1，而HMGB1 不可控制地釋放會觸發和誘導炎癥反應，對機體產生損傷，因此，HMGB1 是缺血再灌注損傷后炎癥反應的早期介質[4，16]。TLR4 是HMGB1 的膜受體之一，研究[17]發現，在心肌缺血再灌注損傷時，HMGB1/TLR4 軸在心肌細胞的凋亡過程中發揮重要的促進作用，其作用機制可能與HMGB1/TLR4 相關信號通路中細胞因子釋放和炎癥反應有關。 HMGB1 與TLR4 結 合 后， 也 可 通 過 激 活NF-κB 信號通路促進炎性因子的表達，加重機體炎癥反應[18]。 本研究中， H/R 損傷心肌細胞HMGB1 和TLR4 的表達及NF-κB 磷酸化激活水平均明顯高于對照組正常細胞， 而表兒茶素和HMGB1 抑制劑可抑制HMGB1 和TLR4 H/R 損傷心肌細胞中HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路的表達及NF-κB 磷酸化激活水平。表明表兒茶素與HMGB1抑制劑對H/R損傷心肌細胞的修復作用相似，其機制可能與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路有關。

通過調控機體內炎癥反應相關通路，提高缺血組織器官對再灌注損傷的抵抗能力，對心肌缺血再灌注損傷產生內源性的保護作用，被稱為缺血預處理。綜上所述，將表兒茶素干預作為缺血預處理，通過調控HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路可發揮抑制缺血再灌注損傷細胞凋亡的作用。表兒茶素對缺血再灌注損傷具有修復作用，可為臨床上心肌缺血再灌注損傷的治療提供新思路，值得進一步研究探討。