黃芪治療糖尿病腎病的網絡藥理學機制

饒雅雯， 劉敏， 孫治中

（廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease）是糖尿病嚴重的微血管并發癥，可進展為終末期腎病，是糖尿病致死、致殘的主要原因。我國糖尿病腎病在終末期腎病中占16.4%，未來可能會成為終末期腎病的首位病因[1]。而臨床上，糖尿病腎病早期中醫藥治療的介入，對延緩病情的惡化及發展有顯著的療效。中醫學并沒有糖尿病腎病這一病名，多從 “水腫”“關格” 方面論治，認為其總體病機為本虛標實，本虛指氣陰兩虛、臟腑內虛，尤其指脾腎兩臟，標實多為燥熱、瘀血、痰濁、水濕等。故具有補中益氣、利尿托毒作用的黃芪是其常用的一味中藥。有研究[2]表明，在2 884 篇中醫治療糖尿病腎病的文獻中，黃芪是出現頻次最高的藥物，達2 204 次。由于中藥成分具有多樣性，目前，黃芪的研究多針對其中某一成分，其具體機制尚不明確。而網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對藥物的有效成分進行多靶點、多通路的生物系統網絡圖分析[3]。本研究基于網絡藥理學的技術與方法，對黃芪治療糖尿病腎病的作用機制進行研究，以期為下一步的研究提供相關依據，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1. 1活性成分的獲取以 “黃芪” 為檢索詞，通過中藥系統藥理學技術平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索其化學成分，將口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為活性成分篩選條件，篩查出符合條件的活性成分，點擊其成分的詳細信息，保存活性成分的2D結構。

1. 2預測黃芪相關靶點在Pubchem 數據庫中檢索篩選出的黃芪的活性成分，找出它們對應的smile號，保存為SDF文件，上傳至SwissTargetPrediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）。 基于反向分子對接原理，依據成分的2D/3D結構進行靶點預測，得到黃芪的預測靶點。

1. 3糖尿病腎病相關靶點的獲取及與黃芪預測靶點的映射以“diabetic kidney disease” 為檢索詞，通過Cards 數據庫獲取糖尿病腎病相關靶點。將黃芪的預測靶點與糖尿病腎病相關靶點進行映射，得到黃芪治療糖尿病腎病的預測靶點。

1. 4蛋白相互作用（PPI）網絡的構建通過String數據庫獲取黃芪治療糖尿病腎病的預測靶點之間的 “蛋白-蛋白” 相關作用關系，導入Cytoscape 3.6.0軟件作為黃芪治療糖尿病腎病的PPI網絡。

1. 5 Hub網絡的提取通過Cytoscape 3.6.0 軟件Tools 模塊中NetworkAnalyzer- Network Analysis-Analyze Network 進行網絡分析獲取相關拓撲參數，選取節點連接度（Degree）的二倍中位數、“節點介度（Betweenness）” 和 “節點緊密度（Closeness）” 的中位數作為篩選依據，提取出Hub網絡。

1. 6基因本體論（GO）富集分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析應用Cytoscape 3.6.0中ClueGO 插件，選擇Biological Process（生物進程），對Hub 網絡中的靶標進行GO 富集分析。通過DAVID 網站（https：//david.ncifcrf.gov/）對上述分析結果進行KEGG通路分析、篩選，得到顯著富集（P ＜0.01）的通路，并按照Gene 數從大到小排序。結合文獻檢索，篩選出治療糖尿病腎病的可能通路。找到其通路上的相關靶標，結合黃芪的活性成分，構建出 “黃芪活性成分-糖尿病腎病靶標-KEGG通路” 的網絡圖。并且選取與黃芪治療糖尿病腎病的相關通路，使用OmicShare 網站（http：//www.omicshare.com/tools/）繪制通路氣泡圖。

1. 7分子對接驗證成分與靶點的結合能力運用SystemsDock 網 站（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）對Degree值排名前5位的預測靶標與黃芪活性成分進行分子對接，通過比較與原生配體的結合分值大小來評價結合的穩定性。

2 結果

2. 1黃芪活性成分本研究以OB≥30%、DL≥0.18為活性成分篩選條件，共篩選出18 種化合物，其名稱、相關參數及化學結構式見表1。

2. 2黃芪預測靶點以及活性成分-糖尿病腎病靶點網絡構建在SwissTargetPrediction 數據庫中篩選出18 種活性化合物對應的255 個靶點，依據成分的2D/3D結構進行靶點預測，篩選出853個靶點作為黃芪的預測靶點。將所得的黃芪預測靶點與GeneCards 數據庫獲取的3 629 個糖尿病腎病相關靶點相映射，篩選出黃芪可能與糖尿病腎病相關的靶點278個。

在Cytoscape 3.6.0 軟件中導入黃芪的活性成分與糖尿病腎病相關的靶點，構建黃芪活性成分-糖尿病腎病靶點網絡圖（見圖1）。如圖1 所示，此網絡中共包括296 個節點，其中包括18 個化合物和278個靶點，746條邊。

表1 黃芪活性成分Table 1 Data of the active components of Radix Astragali

2. 3 PPI網絡的構建將278個黃芪可能與糖尿病腎病相關的靶點導入String 數據庫得到蛋白-蛋白相關作用關系，通過Cytoscape 3.6.0 軟件，形成黃芪治療糖尿病腎病的PPI 網絡（見圖2）。如圖2 所示，此網絡中共包括278 個節點，1 208 條邊。圖中節點大小是按Degree 值的大小形成，Degree 值越大，節點越大。

圖1 黃芪活性成分-糖尿病腎病靶點網絡圖Figure 1 Network of active ingredients from Radix Astragali-diabetic kidney disease targets

圖2 黃芪治療糖尿病腎病的PPI網絡Figure 2 PPI network of Radix Astragali for treatment of diabetic kidney disease

2. 4 Hub網絡的提取及Hub中的靶標選取Degree的二倍中位數、 Betweenness 和Closeness 的中位數作為篩選依據，通過Cytoscape 3.6.0 軟件得到Hub中的靶標，即黃芪治療的糖尿病腎病關鍵靶點，提取出Hub網絡（見圖3）。

圖3 Hub網絡Figure 3 Hub network

結果關鍵靶點有12個，具體為蛋白激酶Bα亞型（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管內皮生長因子（VEGF）、 絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、熱休克蛋白90α（HSP90α）、轉錄調節因子（JUN）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（CASP3）。

2. 5 GO富集分析應用Cytoscape 3.6.0 中的ClueGO 插件，進行GO 富集中的BP 分析，得到13 個功能組別（見圖4）以及其占比餅狀圖（見圖5）。結果中主要富集在MAPK cascade、peptidyl-tyrosine phosphorylation、myeloid cell differentlation、negative regulation of protein modifitication process 等功能組別上。

圖4 GO富集分析功能組別圖Figure 4 Functional group diagram for GO enrichment analysis

圖5 GO富集分析功能組別占比餅狀圖Figure 5 Pie chart for functional group proportion by GO enrichment analysis

2. 6 KEGG通路分析通過KEGG 通路分析得到86 條通路，結合文獻檢索，篩選出治療糖尿病腎病的可能通路為16 條，繪制通路氣泡圖（見圖6）：Smad 信號通路、蛋白激酶B（AKT）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路、Wnt 信號通路，mTOR 信號通路、酪氨酸激酶-信號轉導和轉錄激活因子（JAK-STAT）信號通路、一氧化氮合酶（NOS）信號通路、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）信號通路、細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路、核因子kappaB（NF-κB）信號通路、環鳥苷酸—蛋白激酶G（cGMP-PKG）信號通路、T 細胞受體信號通路，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、環磷酸腺苷（cAMP）信號通路、Toll 樣受體4（TLR4）信號通路、胰島素生長因子（IGF）信號通路。

2. 7分子對接運用SystemsDock 網站對Degree值排名前5位的預測靶標與黃芪活性成分進行分子對接，根據DockingScore 值的大小通過GraphPiad Prism 7.0 軟件制作出熱圖（見圖7）。DockingScore值在4.25 以上認為分子與靶點有一定的結合活性，大于5.0 說明有較好結合活性，大于7.0 說明具有強烈的結合活性。熱圖結果顯示，大部分Docking Score值高于4.25，提示黃芪活性成分與預測靶標有一定的結合能力。

圖6 KEGG通路氣泡圖Figure 6 Bubble diagram for the KEGG pathway enrichment

3 討論

目前針對黃芪的研究局限于單一成分、單靶點，其具體機制尚不明確，運用網絡藥理學可從分子水平對黃芪治療糖尿病腎病的作用機制進行預測分析。

圖7 黃芪治療糖尿病腎病預測靶標與活性成分分子對接熱圖Figure 7 Heat map for molecular docking of predicted targets with active ingredients

預測結果表明，黃芪治療糖尿病腎病的關鍵靶點有12 個，具體為AKT1、TNF、IL6、MAPK3、VEGF、MAPK1、MMP9、MAPK8、mTOR、HSP90α、JUN、CASP3。

其中，AKT1參與了蛋白合成、血管形成等機體新陳代謝細胞應答過程，故其導致糖尿病腎病發生主要與引起過度的細胞外基質在腎間質沉積相關[4]。TNF 則是通過啟動一系列的炎癥反應，導致細胞內膜損傷，腎小球濾過屏障受損，從而形成蛋白尿[5]。IL-6的過度表達，會導致腎小球系膜增生、腎小球基底膜厚度增加，進而導致蛋白尿的產生[6]。MAPK3、MAPK1、MAPK8 在糖尿病腎病的發病過程中，可能參與腎小球系膜細胞表型轉化，導致腎小球細胞外基質堆積，造成腎小球硬化[7]。VEGF 可能與足細胞損傷相關，并可增加細胞內鈣離子內流[8]。有研究[9]表明，高糖環境可誘導體外培養的足細胞高表達MMP9，且可能主要在浸潤巨噬細胞、小管上皮細胞、足突狀細胞、小球系膜細胞等處[10]。mTOR 導致糖尿病腎病的發生可能與抑制足細胞自噬反應相關[11]。HSP90α 可能通過影響eNOS 活性，引起內皮功能障礙[12]。而轉錄調節因子JUN 表達的增加，會誘導Nephrin 表達下調，引起足細胞功能異常[13]。

KEGG 富集通路分析發現16 條通路與糖尿病腎病發病密切相關，大多數已有臨床或實驗研究證據支持，少部分仍有待于進一步研究。Smad 信號通路主要是通過TGF-β1這一被公認為是具有致纖維化的細胞因子，參與糖尿病腎病中腎間質纖維化的過程[14]。PI3K 通路是胰島素信號轉導的主要途徑，與葡萄糖代謝有著密切關系，PI3K 信號通路、AKT 信號通路在調控絲氨酸蛋白激酶-3β，進而在糖尿病腎病系膜細胞增生、細胞外基質積聚、上皮細胞-間充質轉化等方面扮演重要的角色[15]。而PI3K/AKT通路的關鍵下游因子是NF-κB，NF-κB 信號通路的激活，進而介導炎癥因子不斷釋放，加速糖尿病腎病的發生發展[16]。Wnt信號通路在糖尿病腎病病程中，一是通過β-catenin 的大量合成，激活促纖維化因子的釋放，導致腎組織纖維化，二是Wnt-1 高表達，可誘導足細胞損傷，并加劇腎細胞的凋亡[17]。機體自身可以通過自噬調節減輕高血糖、高胰島素血癥等應激所導致的損傷，但mTOR信號通路的激活可能抑制機體的自噬調節，從而導致腎臟纖維化[18]。糖尿病腎病持續的高糖環境會激活JAK/STAT 信號通路，導致腎臟間質成纖維細胞大量增殖，引發腎間質纖維化[19]。JNK 通路能夠被糖尿病腎病患者機體內應激、炎性細胞因子等多種因素激活，誘導足細胞凋亡，引起腎小球濾過功能障礙[20]。ERK信號轉導通路可在高糖環境下被激活，引起細胞肥大及TGF-β 的表達上調，損傷足細胞，誘導免疫反應，導致糖尿病腎病的發生[21]。糖尿病腎病患者由于長期高血糖及代謝紊亂，使機體處于氧化應激狀態，激活MAPK信號通路，既可介導TGF-β1誘生的系膜區基質沉積，也可進一步活化細胞凋亡因子Caspase-3，引起足細胞凋亡[22]。cAMP 信號通路可能是通過激活體內蛋白激酶A（PKA），調控水通道蛋白5（AQP5），影響尿液的濃縮稀釋功能，最終造成腎小球濾過功能障礙[23]。TLR4 信號通路是Toll樣受體信號通路中的一類，是介導炎性反應信號通路，巨噬細胞的浸潤導致腎間質單核細胞局部廣泛聚集，且與腎小球硬化指數和程度呈正相關[24]。有研究發現，IGF 信號通路可以抑制糖尿病腎病中腎小管上皮間質細胞分化[25]。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學的方法和技術，預測了黃芪通過多成分、多靶點、多通路治療糖尿病腎病的作用機制，認為黃芪可能是通過抑制促纖維因子的釋放，抑制炎癥因子分泌，參與抗炎反應，調節自噬功能，降低氧化應激等，進而改善糖尿病腎病腎功能，延緩病情發展。此為進一步深入探討黃芪治療糖尿病腎病的藥效物質基礎及作用機制指明了研究方向。