蝦青素對腦出血大鼠的神經保護作用及對Toll樣受體4/核因子κB介導的神經炎癥反應的影響▲

涂 婷 鄭曉梅 左清嬌 周子薇 先 耀

(西南醫科大學附屬醫院神經內科，四川省瀘州市 646000，電子郵箱：1054328488@qq.com)

腦卒中已成為威脅全球居民生命健康的重大疾病[1]，其中出血性腦卒中具有發病率高、死亡率高以及致殘率高的特點，嚴重危害患者的生命健康和生活質量。研究表明，血腫周圍的腦組織在腦出血早期就已出現炎癥細胞和炎癥因子的浸潤，而這加重腦水腫[2]，因此，減輕炎癥反應是緩解腦出血后繼發性腦損傷的關鍵。腦出血后，血腫成分通過激活小膠質細胞觸發炎癥通路，而主要在小膠質細胞中表達的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)作為一種模式識別受體，在免疫識別、炎癥調節等各個方面扮演著重要的角色[3]，其被激活后可以通過調控核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)信號通路促使大量的促炎細胞因子生成并釋放，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-1β等，從而引起強烈的炎癥反應[4]，因此抑制TLR4信號通路的激活有利于控制炎癥反應。天然蝦青素是一種類胡蘿卜素類植物化學物，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、免疫增強等作用[5]。此外，蝦青素可有效通過血腦屏障，直接作用于中樞神經系統[6]，故近年來蝦青素的神經保護作用受到廣泛關注。本研究分析蝦青素對腦出血大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表達的影響，探究蝦青素的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無病原體級的SD雄性大鼠80只，體質量(250±10)g，購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證編號:SCXK(川)2015-030。均飼養于西南醫科大學動物房，用標準飼料喂養，飲用自來水，自然光照，平均室溫(25±2)℃。

1.2 主要試劑 蝦青素(索萊寶科技有限公司，批號:SA8730)、TLR4抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，批號：ab22048)、NF-κB抗體(美國CST公司，批號：ab16502)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(英國Abcam公司，批號：ab37168)、酶聯免疫吸附測定法試劑盒(南京奧青生物技術有限公司，TNF-α批號：ANG-E11043R-1；IL-1β批號：ANG-E14252G)、辣根過氧化物標記的山羊抗兔二抗(武漢ASPEN公司，批號：AS1107)、二喹啉甲酸蛋白質濃度測定試劑盒(武漢ASPEN公司，批號：AS1086)、RIPA裂解液(武漢ASPEN公司，批號：AS1004)、顯影定影液(武漢ASPEN公司，批號：AS1027)、光學顯微鏡(日本Olympus 公司，型號:CX-21)、冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號:TGL-16)。

1.3 實驗方法

1.3.1 腦出血模型的建立與分組干預：(1)分組。按隨機數字法將大鼠分為假手術組、腦出血組、蝦青素低劑量組、蝦青素高劑量組，每組20只。(2)建模。參照文獻[7]采用自體血注入法建立大鼠腦出血模型。大鼠稱重后，給予3%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定于腦立體定位儀上，定位右側尾狀核(以前囟為中心，向后 0.2 mm，右側旁開3 mm，深6 mm)，鉆孔。除假手術組外，其余3組大鼠斷尾取血，采用經典的“改良二次注血法”注血，第1次勻速注血20 μL(耗時2 min,留針7 min)，第2次以同樣速度注血30 μL(耗時4 min,留針10 min)，緩慢拔針、縫合、消毒，并對大鼠做好標記。假手術組經顱骨鉆孔后注入等體積生理鹽水。(3)干預。造模3 h后，參照文獻[8]分別給予蝦青素低劑量組和蝦青素高劑量組大鼠20 mg/kg、80 mg/kg的蝦青素灌胃(蝦青素采用花生油稀釋成1 mg/mL)，假手術組和腦出血組給予等量花生油灌胃，均1次/d，連續3 d。最后一次灌胃后進行相關指標檢測，每項指標各組均隨機取5只大鼠進行相關標本采集。

1.3.2 神經功能缺損評估及腦組織含水量的測定：隨機取5只大鼠按Garcia評分[9]標準對大鼠進行神經功能評分，分數越低，說明神經功能障礙越重。過量麻醉(10%水合氯醛，劑量為0.35 mL/100 g)處死5只大鼠，斷頭取腦，稱量濕重，在90℃烤箱烘烤至恒重，稱量干重，計算腦組織含水量,腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.3 酶聯免疫吸附測定法檢測TNF-α和IL-1β的含量：過量麻醉(1%水合氯醛，劑量為0.35 mL/100 g)處死5只大鼠，斷頭取腦，取血腫周圍(0.2～0.3 cm)腦組織，加入RIPA裂解液(每100 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液)勻漿，1 000 r/min離心15 min，留取上清液，嚴格按試劑盒說明書進行操作，檢測TNF-α和IL-1β的含量。

1.3.4 免疫組織化學法檢測TLR4 和 NF-κB蛋白的表達：過量麻醉(1%水合氯醛，劑量為0.35 mL/100 g)處死5只大鼠，斷頭取腦，取血腫周圍腦組織用4%多聚甲醛固定后，用石蠟包埋，連續切片，厚度4 μm。置于載玻片上，4 ℃保存。將備用切片參照試劑盒說明書進行操作。于Olympus光學顯微鏡下觀察，胞漿或胞核呈棕黃色者為陽性細胞。應用 ImagePro Plus 6.0專業圖像分析軟件測量TLR4陽性細胞表達的累積光密度值和NF-κB的陽性細胞率(%)。選擇經免疫組化染色后的NF-κB切片，于低倍(40倍)顯微鏡下定位血腫周圍腦組織區域，切換至高倍(400倍)顯微鏡下選取5個不重復視野進行拍照，采集圖像后用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件計算陽性細胞率；細胞核呈棕褐色為NF-κB表達陽性的細胞。

1.3.5 免疫印跡試驗法檢測TLR4和NF-κB蛋白的含量：過量麻醉(1%水合氯醛，劑量為0.35 mL/100 g)處死5只大鼠，斷頭取腦，取血腫周圍腦組織，提取總蛋白，采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，上樣行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠后進行轉膜，封閉(5%脫脂牛奶室溫封閉1 h)，加入稀釋好的一抗(TLR4為1 ∶1 000；NF-κB為1 ∶2 000；GAPDH為1 ∶10 000)，4℃冰箱中孵育過夜，用TBST洗3次，5 min/次，加稀釋好的二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h，最后用TBST在搖床上洗4次，5 min/次，根據不同的光強度調整曝光條件進行顯影、定影。膠片采用AlphaEaseFC軟件處理系統分析，以GAPDH作為內參，以目的條帶的灰度值/GAPDH條帶的灰度值為目的蛋白相對表達量。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較依據方差齊性檢驗采用LSD-t法或Dunnett T3法。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 4組大鼠Garcia 評分及腦組織含水量比較 假手術組、蝦青素高劑量組、蝦青素低劑量組、腦出血組的 Garcia 評分均依次降低，腦組織含水量依次增加(均P<0.05)，見表1。

表1 4組大鼠Garcia評分及腦組織含水量比較(x±s)

2.2 4組大鼠血腫周圍腦組織TNF-α、IL-1β表達水平比較 假手術組、蝦青素高劑量組、蝦青素低劑量組、腦出血組TNF-α、IL-1β表達水平均依次增加(均P<0.05)，見表2。

表2 4組大鼠血腫周圍腦組織TNF-α、IL-1β表達水平比較(x±s，pg/mg)

2.3 4組大鼠血腫周圍腦組織TLR4、NF-κB蛋白的表達水平比較 免疫組織化學法及免疫印跡試驗法檢測結果均顯示，假手術組、蝦青素高劑量組、蝦青素低劑量組、腦出血組TLR4、NF-κB蛋白的表達水平均依次增加(均P<0.05)，見圖1及表3。

圖1 免疫印跡試驗法檢測各組血腫周圍腦組織中TLR4、NF-κB的蛋白表達

表3 4組大鼠血腫周圍腦組織TLR4和NF-κB蛋白的表達水平比較(x±s)

3 討 論

腦出血后，血腫周圍腦組織的炎癥反應是介導繼發性損傷的主要病理機制，因此目前對腦出血后過度炎癥反應的干預仍然是研究熱點。炎癥的發生機制涉及小膠質細胞的活化、炎性細胞的滲入、細胞因子和炎癥趨化因子的釋放，以上事件最終導致細胞死亡，從而加劇腦損傷。TLR4主要在小膠質細胞中表達，為一種模式識別受體[3]，在觸發炎癥通路中起重要作用：細胞外信號與小膠質細胞TLR4受體結合后誘導NF-κB活化，NF-κB激活后進入細胞核內與DNA結合，通過調控TNF-α、IL-1β等炎癥因子的轉錄，使炎癥介質過表達并最終形成炎癥瀑布效應；而TNF-α、IL-1β等炎癥因子同時又是NF-κB的激活劑，由此形成惡性循環，導致持久的炎性反應，進而加重腦水腫及神經細胞損傷[10-11]。因此，負性調控TLR4介導的炎癥信號通路，是減輕腦出血后繼發性炎癥損傷的關鍵環節。

蝦青素是一種重要的脂溶性類胡蘿卜素，可通過血腦屏障，進而在中樞神經系統中發揮抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等作用。早在1999年，蝦青素的食用安全性就已經得到了廣泛的認可，其被美國食品藥物管理局批準作為膳食添加劑[12]。大量研究表明，蝦青素能明顯減輕中樞神經系統損傷，發揮神經保護作用。例如，Zhang等[13]的研究結果表明，早期使用蝦青素可以抑制蛛網膜下腔出血大鼠小膠質細胞的活化，抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活，減少促炎因子IL-1β、TNF-α、細胞間黏附分子1的表達，從而對早期腦損傷起改善作用。吳杰等[14]研究發現，蝦青素可抑制炎癥因子的表達，減少腦梗死體積，改善神經功能，發揮神經保護作用。還有研究表明，蝦青素對脂多糖刺激下IPEC-J2細胞中炎癥因子的表達有抑制作用，其對細胞的保護作用與TLR4/髓樣分化因子88/NF-κB 信號通路相關[15]。此外，蝦青素還被證實在腦梗死、蛛網膜下腔出血、腦外傷、脊髓損傷、帕金森綜合征等疾病中具有神經保護作用[8,13,16-18]，但國內外有關蝦青素對腦出血大鼠的神經保護作用研究報告較少。本研究觀察蝦青素對腦出血大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表達的影響，探討其可能的腦保護機制。

本研究結果顯示，假手術組、蝦青素高劑量組、蝦青素低劑量組、腦出血組Garcia評分依次降低，而腦組織含水量及血腫周圍腦組織TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β的表達水平依次增加(均P<0.05)，與相關研究結果[13]相似，提示蝦青素可能通過抑制腦出血大鼠TLR4、NF-κB蛋白的表達，從而下調炎癥因子TNF-ɑ、IL-1β的表達，減輕炎癥反應，發揮保護神經功能的作用，且其保護作用有劑量依賴性。

綜上所述，蝦青素對腦出血大鼠具有一定的神經保護作用，其作用機制可能為抑制血腫周圍組織TLR4/NF-κB信號通路的激活，從而下調炎癥因子TNF-ɑ、IL-1β的表達，從而減輕繼發性炎癥損傷及腦水腫。但蝦青素腦保護作用的具體機制仍不清楚，且最佳使用劑量仍不確切，有待今后更深入的研究以明確。