千里光石油醚提取物對LPS激活的炎癥反應的抑制效應

楊卉卉，沈金花，劉慶華，彭勇波

中南民族大學生命科學學院/武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074

炎癥反應是機體抵御外界刺激的一種重要防御機制，適當的炎癥反應對機體有保護作用，但過度的炎癥反應可引發級聯放大效應并造成全身炎癥反應綜合征(SIRS)甚至危及患者的生命[1]。巨噬細胞是機體病理性炎癥過程的主要免疫細胞之一[2]，其異常激活能通過響應炎癥應答信號，產生大量炎性因子并引發炎癥介質的級聯釋放，從而誘導組織損傷，甚至多功能器官的衰竭等[3]。因此，調控巨噬細胞炎癥應答對抗炎及炎性相關疾病的治療具有重要意義。目前，針對炎癥主要采用抗生素治療，但抗生素的長期使用會產生抗藥性、降低機體免疫力并加重肝腎損傷等。因此，從天然中草藥中篩選具有顯著抗炎效果、安全無毒并且價格低廉的藥物已經成為當前動物養殖中開發抗生素替代藥物的熱點方向之一。

千里光(SenecioscandensBuch.-Ham.)為菊科千里光屬多年生草本植物，在我國西藏、陜西及南方多省均有廣泛分布，是我國常用的一味傳統中藥材，臨床上多用于急性炎性疾病的治療。對千里光現代藥理學研究表明，其主要含有鞣質、黃酮、酚酸、揮發油、生物堿及萜類等生物活性成分，并主要具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗癌及抗病毒等多種藥理學作用[4-5]。

近年來,千里光因其廣泛的藥用價值而得到越來越多學者的關注[4,6]，但目前有關千里光對巨噬細胞炎癥調控作用及機制的研究還未見報道。鑒于千里光具有抗炎作用及能治療多種炎癥性疾病的特性，本研究以千里光石油醚提取物(petroleum ether extract ofSenecioscandens，PEESS)為材料，通過CCK-8法檢測細胞增殖、Griess法檢測NO含量、RT-PCR法及Western blot法檢測炎癥相關因子表達，綜合探討了千里光的抗炎作用及可能的分子機制，旨在為將其用于動物炎癥性疾病的治療及替代動物養殖中抗生素的使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

千里光干燥全草購于北京同仁堂武漢藥店，產地：湖北。稱取經粉碎的千里光細粉500 g，10倍水3次加熱回流煎煮后合并濾液并旋蒸濃縮，再經石油醚萃取后旋蒸濃縮提取獲得千里光石油醚提取物(浸膏狀)并用PBS配制為10 mg/mL的儲存液低溫保存備用。小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7購于武漢CCTCC細胞庫。

1.2 主要藥物及試劑

胎牛血清(ScienCell，美國)；DMEM培養基、青霉素-鏈霉素、0.25%胰酶(Hyclone，美國)；脂多糖(Sigma，美國)；CCK-8試劑盒、反轉錄試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)；RIPA裂解液、總NO檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、化學發光顯影液ECL Plus(上海碧云天生物技術有限公司)；蛋白酶抑制劑Cocktail(Bimake，美國)；NF-κB p65、MAPK p44/p22及其磷酸化抗體、β-actin抗體(Cell Signaling Technology，美國)；2×PfuPCR Master Mix(北京康為世紀生物科技有限公司)。

1.3 細胞培養與分組處理

將生長狀態良好的RAW264.7細胞以2×104/孔的密度接種于12孔板，每孔加1 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱培養4 h后，將細胞隨機分為5組，即對照組(細胞+培養基)、LPS組(1 μg/mL的LPS+細胞)、試驗組(PEESS+1 μg/mL LPS+細胞)，每組5個重復，PEESS預處理RAW264.7細胞質量濃度分別為20、40、80 μg/mL，處理20 h后，添加終質量濃度為1 μg/mL的LPS刺激細胞。

1.4 CCK-8法檢測PEESS對RAW264.7的細胞毒性

制備單細胞懸液(2×104個/mL),100 μL/孔接種于96孔板中，培養12 h，再用不同質量濃度的PEESS(20、40和80 μg/mL)處理細胞，24 h后向每個孔中添加10% CCK-8，繼續培養2 h，然后用酶標儀在450 nm處測量每個孔中細胞的OD值。細胞活性=(OD加藥- OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.5 Griess法檢測細胞NO的分泌

制備單細胞懸液(5×104個/mL)，100 μL/孔接種于96孔板中，培養12 h。分組處理細胞后，取細胞上清液50 μL/孔按NO檢測試劑盒實驗流程操作，然后在540 nm處測定OD值，根據標準曲線計算得到細胞分泌的NO含量。

1.6 RT-PCR法檢測炎癥相關基因表達

獲得細胞后，用Trizol裂解提取RNA，再反轉錄得到cDNA用于實時熒光定量PCR，以β-actin為內參，目的基因為IL-1β和IL-6。其中，引物序列：IL-1β上游5′-TCTGTCATTCGCTCCCCACAT-3′,下游5′-AGAGAGCACACCAGTCCAAA-3′；IL-6上游5′-TCCAGAAACCGCTATGAAGTTC-3′，下游5′-CACCAGCATCAGTCCCAAGA-3′。

1.7 Western blot法檢測細胞NF-κB及MAPK通路表達

用含有磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解RAW264.7細胞，每隔15 min振蕩1次，共4次。然后在4 ℃和12 000 r/min下離心15 min。用BCA蛋白質測定試劑盒測定所得蛋白質的濃度。隨后，進行電泳，將分離的蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上，并在封閉溶液中封閉1 h，然后在4 ℃與一抗(1∶1 000)孵育過夜。之后，將膜與二抗(1∶4 000)在25 ℃孵育1 h。用增強的化學發光試劑檢測蛋白質水平，并使用Image J凝膠分析軟件對蛋白條帶強度進行定量。

1.8 數據分析

試驗數據以平均值±標準差(n=3)表示。采用2-ΔΔCt公式計算RT-PCR結果。使用SPSS 22.0、GraphPad Prism 6.0處理數據和繪圖，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 PEESS對RAW264.7細胞生長的影響

為排除PEESS細胞毒性對細胞免疫應答的影響，分別用終質量濃度為20、40、80 μg/mL 的PEESS處理細胞，24 h后使用CCK-8測定法測定PEESS對RAW264.7細胞生長的影響。結果顯示，利用0～80 μg/mL質量濃度范圍內的PEESS處理RAW264.7細胞時，與正常對照組相比，細胞生長無明顯變化(圖1)，這表明0～80 μg/mL質量濃度可用于后續實驗。

2.2 PEESS對LPS刺激RAW264.7細胞NO分泌量的影響

通過測定細胞NO分泌量檢測PEESS對LPS刺激RAW264.7細胞炎癥應答的調控作用，結果如圖2所示，與無LPS刺激的空白對照組相比，LPS刺激RAW264.7可顯著提升NO的分泌水平(P<0.01)；而與LPS處理組相比，不同濃度的PEESS則能顯著抑制NO的分泌，呈現明顯的濃度依賴性(P<0.01)。

圖1 PEESS處理后RAW264.7細胞活性

##代表與對照組比較，P<0.01；**代表與LPS刺激組比較，P<0.01。 下同。## means comparing with control,P<0.01；** means comparing with LPS treated-group,P<0.01.The same as below.

2.3 PEESS對LPS刺激RAW264.7細胞炎癥相關基因mRNA表達的影響

采用RT-PCR檢測炎癥相關基因的表達，結果如圖3和圖4所示，與無LPS刺激對照組比較，LPS刺激RAW264.7細胞24 h能顯著提高炎性因子IL-1β和IL-6的表達 (P<0.01)；而與LPS組比較，20、40、80 μg/mL的PEESS則能顯著抑制LPS刺激的上述2種炎癥因子的表達，并呈現出明顯的濃度依賴性(P<0.05)。表明PEESS具有較好的體外抗炎特性，其抗炎機制很可能與其抑制炎癥因子表達有關。

2.4 PEESS對LPS刺激的RAW264.7細胞中NF-κB、MAPK途徑的影響

NF-κB、MAPK信號通路是炎癥反應的重要調控信號通路，為了進一步證實PEESS可能的抗炎機制，采用Western blot法檢測PEESS對LPS刺激的RAW264.7細胞NF-κB p65和MAPK p44/42蛋白表達及磷酸化水平，結果如圖5所示，LPS處理細胞24 h能顯著提高p65和p44/42蛋白的磷酸化水平(P<0.01)；而與LPS組比較，PEESS則顯著下調了p65與p44/42蛋白的磷酸化水平(P<0.01)，并對p44/42蛋白的磷酸化水平的抑制作用呈現明顯劑量依賴性。上述結果說明PEESS可抑制LPS刺激的RAW264.7細胞中NF-κB、MAPK通路的活化，并呈現一定的劑量依賴性。

圖3 PEESS處理后RAW264.7細胞炎癥

##代表與對照比較，P<0.01；*代表與LPS組比較，P<0.05；**代表與LPS組比較，P<0.01。 ## means comparing with control,P<0.01；* means comparing with LPS treated-group,P<0.05； ** means comparing with LPS treated-group,P<0.01.

圖5 PEESS處理后RAW264.7細胞炎癥模型NF-κB和MAPK通路相關蛋白磷酸化水平的變化

3 討 論

傳統用藥和臨床上，千里光可用于治療眼部感染、風寒發熱、尿路感染、滴蟲性陰道炎及蕁麻疹等[6]，提示其具有良好的抗炎作用。為進一步探討博達的千里光抗炎作用及潛在的機制，本研究在千里光石油醚部提取基礎上，以LPS 誘導的RAW264.7 巨噬細胞炎癥模型為材料，檢測了千里光石油醚提取物的體外抗炎作用和抗炎機制。

巨噬細胞是免疫系統中的一道重要防線，在炎癥發生過程中至關重要[7]。LPS 刺激小鼠來源的巨噬細胞RAW264.7 可誘導和激活細胞免疫應答，釋放NO這一重要的炎癥介質，并分泌如IL-1β、IL-6和TNF-α等在內的促炎因子，從而誘發細胞損傷，促進炎癥反應[8]。在本研究中，與單純LPS刺激組細胞比較，添加PEESS能顯著抑制NO的分泌及炎性因子IL-1β和IL-6的表達水平，這不僅表明PEESS可能通過降低炎癥介質釋放和促炎細胞因子的表達從而發揮體外抗炎作用，也與千里光對炎癥性疾病具有較好的治療作用的報道一致[6]。同時，我們也通過CCK-8檢測其對細胞增殖毒性的影響排除了千里光提取物的抗炎作用不是依賴于其對RAW264.7 細胞的毒性效應而發揮影響作用。

在LPS刺激的細胞炎性應答機制中，LPS通過Toll樣受體家族成員TLR4的介導[9]，激活NF-κB和MAPK信號通路，從而調控LPS誘導的RAW264.7細胞的免疫反應[10]。為了進一步闡明PEESS是否通過影響上述信號通路發揮抗炎作用，本研究進一步檢測了PEESS對NF-κB和MAPK信號通路關鍵信號蛋白表達的影響。NF-κB是連接炎癥的關鍵因子[11]，由p65/RelA、p50、p52、RelB和c-Rel亞基組成，其中p65磷酸化是介導炎癥最關鍵的一步[12]。另一方面，MAPK信號通路可激活AP-1轉錄因子從而誘導促炎細胞因子的表達分泌[13]，在LPS誘導的促炎信號轉導中同樣發揮重要作用[14]。本研究的結果表明，PEESS可顯著地抑制NF-κB和MAPK信號通路中p65及p44/42蛋白的磷酸化水平，從而發揮抗炎的作用。

綜上，PEESS具有良好的抗炎效應，其作用機制可能是通過抑制促炎信號通路NF-κB和MAPK通路中p65及p44/42蛋白的磷酸化，從而抑制促炎細胞因子IL-1β、IL-6等的表達和分泌，但有關上述信號通路相互之間作用，尤其是千里光中具體抗炎活性成分的鑒定還有待進一步的研究。