骨橋蛋白在成釉細胞瘤中的表達及意義

趙嚴禮 張鐵成 唐瞾隆 陳輝 周永強 劉桂才

成釉細胞瘤是口腔頜面部常見的牙源性良性腫瘤之一[1]，約占上下頜骨良性腫瘤的10%，其雖生長緩慢，但具有局部侵襲性的特點。成釉細胞瘤的發病病因不明，多數學者認為其可能來源于各種牙源性上皮細胞，如牙源性濾泡上皮襯里等[2]。成釉細胞瘤的術后復發率較高，往往認為是與其具有局部侵襲性有關，臨床上也可見惡變[3]。現階段，對成釉細胞瘤的治療多采用廣泛手術切除病變骨質和(或)帶血管蒂腓骨或髂骨移植修復頜骨缺損的方法治療該疾病，術后往往對患者的生活質量有一定的影響。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是細胞基質蛋白小整合素結合配體N端連結糖蛋白(small integrin-binding N-linked glycoprotein，SIBLING)家族中的一員[4]，在正常組織中OPN表達水平很低，但在一些腫瘤組織中表達水平較高[5]。本文通過對研究骨橋蛋白在臨床上較常見的成釉細胞瘤中的表達情況，初步探討其與成釉細胞瘤生物學行為的相關性，旨在為臨床上治療成釉細胞瘤提供新的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 實驗組60 例(濾泡型32 例，叢狀型20 例,單囊型8 例)成釉細胞瘤標本取于南通市口腔醫院口腔頜面外科。標本中男31 例,女29 例,年齡12～57 歲,平均30.32 歲。對照組取10 例門診阻生牙拔除時所切除的正常健康牙齦黏膜組織。

1.1.2 主要試劑 透明質酸酶、Anti-Mouse IgG Antibody、Bovine serum albumin(BSA)、DAB substrate(武漢博士德生物有限公司)；Anti-OPN Antibody(美國Baylor大學Dr.Qin實驗室)。

1.1.3 主要儀器 病理石蠟切片機(徠卡公司，德國)；電熱恒溫培養箱(Beckman公司，美國)；高級熒光顯微鏡(Eclipse 90i，日本尼康)。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 常規制片，恒溫加熱箱中70 ℃烘烤切片4 h；二甲苯脫蠟；梯度乙醇水化；蘇木素染色；鹽酸酒精分化；0.5 %伊紅染色；梯度無水乙醇脫水；透明；封片；置于室溫凝固，備用觀察。

1.2.2 免疫組織化學SP法 70 ℃烤片24 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水， 3%過氧化氫處理10 min，修復液37 ℃，孵育60 min，山羊混合血清封閉4 ℃過夜，次日加入稀釋(1∶400)Anti-Osteopontin鼠抗一抗， 4 ℃過夜，次日加入即用型山羊多克隆抗體二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，透明，封片，拍片。

1.2.3 結果判定 胞漿中出現黃色顆粒為陽性著色。評分判斷標準[6]A(按切片中細胞顯色有無及深淺評分)： 0 分為細胞無色； 1 分為淺黃色； 2 分為棕黃色； 3 分為棕褐色。 B(按切片中顯色瘤細胞占切片中瘤細胞的比例評分)： 1 分為25%以下； 2 分為25%～75%； 3 分為75%以上。 每例積分=A×B，按積分高低分為:陰性(-)，積分0 分；弱陽性(+)， 積分1～3 分；中度陽性(++)，積分4～7 分；強陽性(+++)，積分>7。

1.3 數據處理和統計學分析

應用SPSS 17.0統計軟件，采用χ2檢驗分析成釉細胞瘤2 種主要組織學類型與正常牙齦黏膜中骨橋蛋白表達陽性率的差別，P<0.05差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HE 染色

染色結果見圖 1。

2.2 免疫組織化學染色

結果如圖 2，骨橋蛋白在正常的牙齦黏膜呈現陰性表達，在濾泡型成釉細胞瘤上皮細胞的細胞核、星網狀層細胞和瘤周基質呈陽性表達；在叢狀型成釉細胞瘤中的腫瘤上皮內和在腫瘤間的結締組織呈現陽性反應，在單囊型成釉細胞瘤中瘤體細胞的細胞核和瘤周基質呈現陽性反應。

圖 1 確定成釉細胞瘤的組織分型(HE， ×100)

圖 2 各組樣本中OPN的表達(SP, ×200)

濾泡型成釉細胞瘤表達陽性率為24/32(75%)，叢狀型成釉細胞瘤表達陽性率為16/20(80%)，單囊型成釉細胞瘤陽性率5/8(62.5%)。濾泡型成釉細胞瘤和叢狀型成釉細胞瘤及單囊型成釉細胞瘤的OPN的陽性表達均高于正常牙齦黏膜，差別具有統計學意義(P<0.05)(表 1)。

表 1 OPN在各組樣本中表達的比較

3 討 論

OPN富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，是首次發現在骨組織中的骨唾液涎蛋白，隨后的研究發現，在腎、腦、巨噬細胞、血管平滑肌細胞和許多細胞上皮襯里也有表達[7]。OPN的結構中含有豐富的天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸，它是一種酸性的分泌型磷酸化糖蛋白，有多種功能[8-9]，如促進細胞黏附、生存、轉移和調節細胞免疫。研究表明[10-11]，在骨的重建、創傷及炎癥的修復、腫瘤的轉移和自身免疫疾病中也可檢測到OPN的高表達。另外，OPN還可通過激活信號通路來促進腫瘤形成和干擾腫瘤的預后，甚至可導致腫瘤的惡變[12]。成釉細胞瘤雖是一種頜骨良性腫瘤，但其生物學行為具有局部侵襲性，術后復發率比較高。最近的研究證實[13]，OPN在致癌和癌癥的轉移中起著重要的作用。此外，高表達的OPN與各種腫瘤[13-15]，如肝癌、宮頸癌、胰腺癌和前列腺癌的惡變、轉移及預后不良有關。現階段，對成釉細胞瘤中OPN表達的研究較少，本文通過檢測OPN在成釉細胞瘤中的表達情況，探討其在該類腫瘤發生及復發中的可能意義。

本研究結果顯示，在叢狀型，濾泡型及單囊型成釉細胞瘤中，OPN的陽性反應主要表達在類成釉細胞和類星網狀層細胞的細胞核，瘤周反應主要集中于腫瘤基質，在成釉細胞瘤體上皮細胞的細胞核、星網狀層細胞和瘤周基質中OPN的陽性表達率45/60(75%)。而在正常的牙齦上皮細胞中，OPN的表達為陰性或弱陽性，陽性表達率為1/10(10%)。Wang等[16]認為OPN可能由星網狀細胞分泌和合成，通過成釉細胞樣細胞加工修飾分泌到成釉細胞瘤周基質中參與瘤體發生發展，也不排除成釉細胞瘤樣細胞分泌少量的OPN。圖 2中OPN的陽性表達，提示在成釉細胞瘤不同區域OPN的表達也不同，細胞核陽性表達較高，該陽性表達可能提示OPN在該區域活性可能較高。表 1可見，正常牙齦黏膜中OPN的陽性表達均小于濾泡型成釉細胞瘤，叢狀型及單囊型成釉細胞瘤中OPN的陽性表達，且具有統計學意義(P<0.05)。

OPN可以增強腫瘤細胞的轉移、侵襲和轉移，激活破骨細胞，并且可以保護腫瘤細胞抵御免疫介導的細胞毒性反應，成釉細胞瘤瘤體細胞和瘤周結締組織中的高表達的OPN至少可以部分的解釋為什么實性的成釉細胞瘤有局部侵襲行為和較高的溶骨能力[17]。研究表明[18]，在牙源性角化囊腫中的上皮襯里和結締組織中也檢測到OPN的高表達，因此我們可以猜測成釉細胞瘤中OPN的高表達有可能與該腫瘤高復發率有關。

現階段對于成釉細胞瘤的治療，手術仍是首選，創傷較大，易于復發，多次復發手術嚴重影響面容，并造成功能障礙。對患者的生活質量有一定的影響。本實驗結果提示OPN很可能參與成釉細胞瘤的發生發展過程,可通過研究成釉細胞瘤的生物學行為和OPN表達之間的關系，將OPN作為成釉細胞瘤的診斷和評價預后的有效指標。鑒于此，將OPN作為靶基因來治療成釉細胞瘤是有可能的。但OPN能否作為一個有價值的靶向治療, 在成釉細胞治療方面是否起到積極作用，仍需進一步的研究。