耗散型石英晶體微天平實時監測氧化損傷紅細胞與內皮細胞的粘附

肖蘇婷 姚政 周琳 楊培慧

摘?要?紅細胞與血管內皮細胞之間的粘附作用研究對揭示心血管疾病的發病機制具有重要意義。在病理狀態下， 紅細胞的氧化損傷會使胞膜糖蛋白受體中的唾液酸含量下調以及細胞粘彈性質的改變，導致紅細胞與血管內皮細胞的黏附性增強。基于唾液酸與3-氨基苯硼酸具有特異性識別作用，本研究采用耗散型石英晶體微天平（QCM-D）建立了一種實時監測氧化損傷紅細胞與內皮細胞之間粘附的新方法。以H2O2氧化損傷紅細胞為研究模型，通過QCM傳感器實時監測紅細胞粘附過程頻率和耗散因子的變化， 評價其氧化損傷程度。結果表明，隨著H2O2濃度增加，QCM頻率和耗散因子變化值均隨之減小，表明紅細胞的粘附與H2O2濃度和紅細胞的氧化損傷程度呈負相關。為了模擬血管內環境，將血管內皮細胞固定于芯片界面，采用QCM實時監測其與紅細胞的粘附，結果表明，隨著紅細胞損傷程度增加，細胞間的黏附逐漸增強。 本研究建立了一種簡便、免標記、高靈敏、可實時監測細胞間粘附并評價細胞氧化損傷的新方法，拓展了QCM技術在生物體系細胞功能研究中的應用范圍。

關鍵詞?紅細胞; 氧化損傷; 內皮細胞; 黏附; 石英晶體微天平

1?引 言

紅細胞（Red blood cells， RBCs）和血管內皮細胞（HUVECs）的損傷與黏附是導致心血管疾病發生的初始因素。RBCs膜表面含有胞膜糖蛋白C3b 受體，其主要成分為唾液酸，也是RBCs負電荷的主要來源，能夠阻止RBCs聚集。在生理條件下，正常RBCs與血管內皮細胞幾乎不發生黏附; 在病理條件下，如受到氧化損傷時RBCs膜的唾液酸表達量會下調，并發生細胞形態改變和變形能力下降，導致RBCs與血管內皮細胞的黏附增強[1]。研究表明，多種疾病的發生機制與RBCs和內皮細胞間的黏附性增強有關[2]。因此，發展簡便、靈敏、免標記的分析方法實時監測RBCs與內皮細胞的黏附，對深入了解心血管疾病的發病機制具有重要意義。

石英晶體微天平（Quartz crystal microbalance， QCM）是一種具有納克級靈敏度的新型質量傳感分析技術，通過監測石英晶體的共振頻率變化（Δf）可反映晶體表面吸附物質的質量變化，具有高靈敏、免標記、可實時監測等優點[3，4]。耗散型石英晶體微天平（Quartz crystal microbalance with dissipation， QCM-D）可通過監測耗散因子（ΔD）的變化反映晶體表面吸附物質的粘彈性變化，進而反映細胞的形變和硬度。近年來，在細胞黏彈性、細胞粘附和細胞力學性質等方面的研究備受關注 [5～7]。Muramatsu等[8]利用QCM結合顯微鏡技術監測活細胞對抗腫瘤藥物的響應和粘附過程。Cui等[9]利用QCM-D技術實時監測內皮細胞和巨噬細胞在腦蛋白/肝素復合膜上的黏附和擴散，顯示了細胞在含有不同成分薄膜中具有不同的粘附機理。Noiri等[10]通過化學偶聯構建聚乙二醇/磷脂復合膜并修飾RGD多肽用于粘附人臍靜脈內皮細胞，表明細胞粘附行為受液體流動式樣的影響。Yang等[11]構建了聚乙烯亞胺/透明質酸復合膜界面用于特異性識別乳腺癌細胞過表達的CD44分子，以QCM傳感器評估具有不同遷移能力的MDAMB-231和MCF-7乳腺癌細胞的粘附行為。Zhu等[12]以QCM傳感器監測人臍靜脈內皮細胞在金芯片上的粘附、擴散和增殖，并以H2O2氧化損傷內皮細胞，導致其在金芯片上的擴散和覆蓋面積下降，且此過程與H2O2濃度呈正相關。Shoaib等[13]以QCM-D傳感器實時監測H2O2氧化損傷MC3T3小鼠成骨細胞的粘彈性，顯示了氧化損傷對細胞骨架和細胞形態的影響。本研究組利用QCM傳感器結合質量型納米粒子信號放大技術定量檢測了RBCs膜表面的唾液酸[14]，并通過氧化損傷血管內皮細胞，采用QCM傳感器實時監測了RBCs與內皮細胞間的黏附作用[15]。由于在病理條件（如氧化應激、高血糖等）的刺激下會引起RBCs損傷和胞膜糖蛋白C3b 受體中唾液酸表達量下調，導致RBCs與血管內皮細胞間的黏附增強，因此，發展QCM傳感器表征氧化損傷RBCs與血管內皮細胞之間的粘附作用，將有助于理解心血管疾病的發病機制，并同時為細胞功能研究提供新思路。

因此，本研究以H2O2氧化損傷RBCs為研究模型，基于氧化損傷RBCs引起的膜表面唾液酸表達量下調和細胞粘彈性改變導致RBCs與內皮細胞間的黏附增強， 采用QCM-D傳感器實時監測氧化損傷RBCs與血管內皮細胞間的粘附（如圖1所示）。利用3-氨基苯硼酸（3-Aminophenylboronic acid， APBA）特異性識別RBCs膜表面的唾液酸，以APBA功能化的金芯片捕獲RBCs，通過頻率變化監測不同損傷程度RBCs的黏附; 以聚賴氨酸（Polylysine， PLL）非特異性界面通過粘附內皮細胞模擬血管內環境，通入損傷RBCs，連續追蹤細胞間的粘附，為表征細胞間的粘附以及細胞功能研究提供了新方法。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

KSV Z-500石英晶體微天平（KSV Instrument公司）; CHI660a電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）; Zetasizer Nano Zeta電位儀（英國馬爾文儀器有限公司）; 5 MHz AT切型金芯片（晶體直徑14 mm，電極直徑10 mm，深圳市仁路科技有限公司）。

APBA、 PLL、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride， EDC）、 N，N-二甲基甲酰胺（N，N-Dimethyl formamide， DMF）均購自美國Sigma公司，巰基丁二酸（Mercaptosuccinic acid， MSA）、維生素C（Vitamin C， Vc）均購自上海阿拉丁試劑公司，以上試劑均為分析純; 30% H2O2（上海阿拉丁試劑公司）; 槲皮素（Quercetin， Que， 純度97%，上海源葉生物科技有限公司）; 胎牛血清、RPMI-1640培養基、0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖溶液 （Phosphate buffer saline， PBS）均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司; 實驗用水為超純水。

2.2?內皮細胞的培養和RBCs的處理

HUVECs來源于暨南大學醫學院，接種于含有10%胎牛血清和1%內皮細胞生長添加物的RPMI-1640培養基中，在5% CO2、37℃的培養箱中培養，每隔2～3天進行傳代。用0.25%胰蛋白酶消化內皮細胞，并取對數生長期的HUVECs用于QCM實驗。

正常人全血來源于暨南大學附屬第一醫院，按照文獻[13]的方法從正常人全血中分離出RBCs，接著用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L H2O2分別處理RBCs 2 h，再用PBS清洗并離心得到不同氧化損傷程度的RBCs懸液。Que保護RBCs的處理方法是在1.0 mL PBS中加入RBCs懸液0.1 mL，再加入50 μmol/L Que處理10 min，接著加入0.6 mmol/L H2O2溶液調節至總體積為2.0 mL，作用2 h。維生素C處理RBCs的方法與Que相同。

2.3?QCM-D的測量

金芯片的預處理： 用超純水超聲清洗15 min，再用Piranha溶液（30% H2O2-H2SO4， 1∶3， V/V）清洗5 min，然后交替用30%乙醇和蒸餾水各清洗3次，最后用N2吹干，備用。在干凈的金芯片表面滴涂5 mmol/L MSA，室溫過夜后，用乙醇和水依次交替清洗2～3次。將修飾的MSA金芯片用2.0 μg/mL PLL孵育2 h，用超純水清洗除去過量的PLL，得到MSA/PLL功能化金芯片; 用100 mmol/L EDC的DMF溶液處理15 min，活化金芯片表面的羧基，加入20 mmol/L APBA孵育1 h，然后用蒸餾水沖洗金芯片上過量的APBA，得到APBA功能化金芯片。

將功能化金芯片安裝于QCM流通池中，設置流速為200 μL/min，調節系統溫度控制保持25℃，通入PBS緩沖溶液待基線穩定，通入1 ×105 cells/mL RBCs或內皮細胞，記錄諧波次數n=3時Δf和ΔD隨時間變化的曲線。

2.4?電化學實驗方法

采用上海辰華公司CHI660a電化學工作站，以QCM流通池作為電化學池，電解質溶液為10 mmol/L [K3Fe（CN）6]3/4+ 0.1 mol/L KCl溶液，采用三電極體系：金芯片工作電極、鉑對電極和Ag/AgCl參比電極，掃描速率100 mV/s，電壓范圍0.2～0.6V，記錄循環伏安曲線。

3?結果與討論

3.1?APBA修飾傳感界面的表征

基于APBA對唾液酸的特異性識別，構建了APBA功能化金芯片界面粘附RBCs，并用QCM和循環伏安法進行表征。由圖2A可知，隨著RBCs通入流通池QCM頻率變化（|Δf|）明顯增大，由于生理狀態RBCs表面表達有唾液酸，其與芯片界面APBA特異性識別發生粘附作用，從而引起頻率明顯下降，表明RBCs粘附于傳感器界面。如圖2B所示，Au/MSA/APBA/RBC的層層修飾阻礙了金芯片的電子傳遞，導致氧化還原峰電流下降，進一步表明了RBCs在傳感器界面上的粘附。將損傷RBCs和正常RBCs分別通入流通池，其頻率隨時間的變化曲線如圖2C所示，損傷RBCs因膜表面的唾液酸含量下調，導致粘附性能下降，其頻率變化低于正常細胞。上述結果表明，構建的QCM傳感器能有效地監測損傷RBCs與正常RBCs在芯片界面粘附行為的差異。

3.2?QCM傳感器實時監測氧化損傷RBCs的黏附

以不同濃度H2O2處理RBCs，采用QCM傳感器于監測不同氧化損傷程度的RBCs黏附。由圖3A可見，頻率變化值|Δf|隨著H2O2濃度增大而降低，由于受H2O2氧化損傷，RBCs唾液酸表達量下降，RBCs在傳感界面粘附減少，|Δf|值回升，表明RBCs的粘附與H2O2濃度和RBCs氧化損傷程度呈負相關; 圖3B為不同濃度H2O2處理RBCs的Zeta電位圖，Zeta電位隨H2O2濃度升高而降低，說明氧化損傷的RBCs所帶負電荷減少，是由于RBCs膜表面帶負電荷的唾液酸表達量下調，這與文獻[16]的結果相符。因此，QCM傳感器可對不同氧化損傷程度的RBCs產生靈敏的信號響應。此外，所構建的APBA功能化傳感界面粘附RBCs具有良好的穩定性，通?？芍貜褪褂?次，QCM頻率測量值的相對標準偏差為6.7%。

3.3?QCM-D傳感器監測氧化損傷RBCs的粘彈性

氧化損傷RBCs會導致細胞力學性質發生變化，在此可用聚賴氨酸非特異性界面QCM-D傳感器監測不同損傷程度RBCs的耗散因子ΔD隨頻率的變化，并以細胞粘彈性指數|ΔD/Δf|表征細胞粘彈性，其值越大，細胞粘彈性越大，細胞形變能力也越大。由圖4A和圖4B可知，|ΔD/Δf|值隨著處理濃度的增加而下降，說明RBCs的粘彈性降低，細胞形變能力下降。由文獻[16]可知，RBCs氧化損傷會導致形變能力下降。進一步將50 μmol/L抗氧化劑AA和Que應用于降低RBCs的氧化損傷，如圖4C所示，相對于單獨0.6 mmol/L H2O2處理組，抗氧化劑保護組的粘彈性指數更接近對照組，而且與對照組相比，抗氧化劑組不存在顯著性差異（p>0.05），表明抗氧化劑對RBCs具有保護作用。

3.4?QCM傳感器實時監測損傷RBCs與內皮細胞間的粘附

以聚賴氨酸非特異性界面粘附血管內皮細胞模擬血管內環境，在流通池中通入損傷RBCs，利用QCM傳感器實時監測RBCs與內皮細胞間的粘附。QCM行為曲線如圖5A所示，其中的Ⅰ區、Ⅱ區和Ⅲ區分別表示QCM頻率響應的PBS基線區、內皮細胞粘附界面區和RBCs粘附區，從Ⅲ區的曲線可知，損傷RBCs的頻率變化明顯大于正常RBCs，說明在血管內皮細胞表面，氧化損傷RBCs比正常細胞具有更強的黏附能力，這與文獻[17]報道正常RBCs的粘附能力較弱相符。此外，第Ⅲ區域的頻率變化隨著處理RBCs的H2O2濃度的增加而增大，如圖5B所示，隨著RBCs氧化損傷程度的增加，RBCs與內皮細胞間的粘附作用增強。

4?結 論

基于QCM發展了一種免標記、高靈敏、連續監測氧化損傷RBCs與血管內皮細胞粘附過程的新策略。通過構建特異性識別唾液酸的APBA功能化傳感界面和模擬血管內環境的血管內皮細胞傳感界面，成功監測到RBCs的黏附和細胞粘彈性均與H2O2濃度呈負相關，并連續追蹤了損傷RBCs與血管內皮細胞的粘附行為，進而可評估RBCs的氧化損傷程度。本研究為表征細胞間的粘附以及細胞功能研究提供了新方法。

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