艾草黃酮抗氧化及對雞胸肉保鮮效果的研究

楊宇華 黃 艷 鄭偉鵬

(武夷學院茶與食品學院，福建 武夷山 354300)

艾草又名蘄艾、灸草，為菊科蒿屬多年野生草本植物[1]。艾草有較豐富的藥用價值，如抑菌、抗過敏、止血、鎮痛[2-3]。艾草的藥理作用與其獨特的天然生物活性成分黃酮息息相關，可有效提高機體免疫力，降低冠心病、高血壓、急慢性肝炎和心肌缺血損傷等疾病的發病率[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

艾草、雞胸肉：市售；

無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、焦性沒食子酸、1,10-菲啰啉、乙二胺四乙酸、氧化鐵、乙酸鉛、抗壞血酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、雙氧水、磷酸二氫鉀、甲基紅、亞甲基藍、硼酸、氫氧化鈉、三氯甲烷：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

鹽酸：優級純，西隴化工股份有限公司；

三(羥甲基)氨基甲烷、2-硫代巴比妥酸：生物試劑級，國藥集團化學試劑有限公司；

2,2-聯苯基-1-苦基肼基：生物試劑級，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

高速萬能粉碎機：PW80型，天津市泰斯特儀器有限公司；

鼓風干燥箱：DHG-9123型，上?？坪銓崢I發展有限公司；

循環水式真空泵：SHZ-DⅢ型，鞏義市予華儀器有限公司；

數控超聲波清洗機：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

高速冷凍離心機：Neofuge 15R型，上海力申科學儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：RE 2000A型，上海亞榮生化儀器廠；

真空冷凍干燥機：FD-1D-50型，北京博醫康實驗儀器有限公司；

恒流泵：HL-2型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

可見光分光光度計：V-1100D型，上海美普達有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-3200PC型，上海美普達有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-S4型，常州中捷實驗儀器公司：

集熱式磁力加熱攪拌器：DF-101S型，常州邁科諾科技有限公司；

酸度計：PB-10型，上海多博科學儀器有限公司；

全溫培養搖床：QYC-200型，上海新苗醫療器械制造有限公司；

自動測色色差計：WSC-S型，上海儀電物理光學儀器有限公司；

高壓均質器：Scientz-150型，寧波新芝有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料處理

(1) 艾草：80 ℃烘干，粉碎，過60目篩，得艾草粉末，再60 ℃烘干至恒重后保存備用。

(2) 艾草黃酮提?。簠⒄諚钣钊A等[8]優化的超聲波輔助提取工藝條件提取艾草總黃酮，得艾草粗提物，收集備用。

(3) 艾草黃酮純化：根據前期預試驗，采用大孔吸附樹脂，按上樣液濃度2.5 mg/mL，上樣液pH值4，吸附溫度20 ℃，上樣速度1.5 mL/min，選用80%乙醇進行洗脫，洗脫流速1.5 mL/min，洗脫用量100 mL的條件進行純化處理。取濾液濃縮后，置于超低溫冰箱24 h后，真空冷凍干燥約24 h，得到純化艾草黃酮干品，留存備用。

(4) 保鮮液制備：將艾草黃酮純化物和抗壞血酸分別配制成水溶液，其質量濃度為0.1～0.5 mg/mL，備用。

(5) 肉樣處理：雞胸肉冷卻排酸24 h，使其中心溫度降至0～4 ℃，于超凈工作臺將其分成約200 g的肉塊，去除筋膜和多余脂肪，平均分成6組，每組3塊，待用。將處理好的6組肉塊分別用0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的黃酮純化物溶液浸泡，10 min后取出，瀝干后用保鮮袋包裝，置于(4±1) ℃冰箱中，定期(第0，2，4，6，8天)對冷卻雞胸肉的各項指標進行測定。

斯大林時期與勃列日涅夫時期特權階層的使命是不同的，斯大林時期“特權階層”的主要使命是維護、鞏固斯大林的體制模式；而勃列日涅夫時期，特權階層的主要使命是抵制各種實質性的改革，維護現狀，使斯大林式的社會主義更加“成熟”。這也是這個時期體制改革停滯不前的一個重要因素。

1.3.2 艾草黃酮體外抗氧化試驗

(1) 總還原能力的測定：采用普魯士蘭法[9]。取1.00 mL 樣液，依次加入pH 6.6的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、1% K3[Fe(CN)6]溶液各2.5 mL，搖勻后將其置于50 ℃水浴20 min后加入2.5 mL 10%的三氯醋酸溶液，搖勻。取混合液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL，與0.5 mL 0.1% FeCl3溶液混合。靜置10 min后于700 nm處測定吸光度。吸光值與還原能力呈正相關。

(1)

式中：

A0——空白組的吸光度值；

A——樣品組的吸光度值。

(2)

式中：

C——·OH清除率，%；

A樣品——加抗氧化劑及過氧化氫的溶液的吸光值；

A損傷——加過氧化氫而不加抗氧化劑的溶液的吸光值；

A未損——兩者都不加的溶液的吸光值。

(4) DPPH自由基(DPPH·)清除率的測定：參照賈靖霖等[12]的方法，根據實際情況稍作修改。移取4 mL pH 6.86標準混合磷酸鹽緩沖液注入10 mL試管中，加入2×10-4mol/L DPPH溶液(95%乙醇配制) 4 mL，搖勻。加樣液1.00 mL，以蒸餾水定容至10.00 mL刻度，混勻，室溫下靜置10 min于520 nm處測定吸光度(95%乙醇作參比)。按式(3)計算DPPH·清除率。

(3)

式中：

C——DPPH·清除率，%；

Ai——加樣液后DPPH溶液的吸光值；

Aj——不加DPPH，只加樣液和水的溶液的吸光值；

Ac——不加樣液，只加DPPH及水的溶液的吸光值。

1.3.3 艾草黃酮應用于雞胸肉保鮮試驗

(1) pH值的測定：稱取5 g樣品，加入50 mL蒸餾水，利用Scientz-150高壓均質器室溫下均質25 s，pH計測定[13]。

(2) 感官評價：對雞肉的色澤、彈性、氣味采用4級評分法評分[14]。感官評價表見表1。

(3) 硫代巴比妥酸值(TBARS值)的測定：參照楊新磊等[15]的方法，根據實際情況稍作修改。取10 g雞胸肉研細，加入7.5% TCA (含0.1%乙二胺四乙酸) 50 mL，連續震搖30 min后雙層濾紙過濾。取5 mL上清液，加0.02 mol/L TBARS溶液5 mL，90 ℃下水浴40 min，冷卻l h后離心5 min，上清液中加入5 mL氯仿搖勻，靜置分層取上清液分別在532 nm和600 nm處比色，記錄消光值。與TBARS反應的物質的量以每千克肉中丙二醛(MDA)的毫克數來表示。按式(4)計算TBARS值。

(4)

式中：

TBARS——硫代巴比妥酸值，mg/100 g；

A532 nm——532 nm處的吸光度值；

A600 nm——600 nm處的吸光度值。

(4) 揮發性鹽基氮(TVB-N值)的測定：按GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》執行。

(5) 色差的測定：利用WSC-S測色色差計測定肉樣的a(紅度)值，儀器使用前分別用黑色陷阱和白板進行儀器校準，按照操作選擇合適的試皿，將肉樣鋪滿試皿底部，置于樣臺上測量，每個樣品隨機測定3次，結果取平均值。從第0天開始計算，每隔1天測量一次并記錄數據。

表1 雞胸肉冷藏期間的感官評價

(6) 硫化氫(H2S)檢驗：采用醋酸鉛濾紙法檢測[16]。肉粒置于錐形瓶中，放入量為錐形瓶的1/3。將乙酸鉛堿性溶液處理過濾紙條懸掛于瓶中，塞緊瓶塞。室溫下靜置15 min，觀察濾紙條的顏色變化。硫化氫檢驗判斷標準見表2。

1.4 數據統計及分析

運用Excel 2016統計分析所有數據及計算標準偏差，應用Origin 8.5軟件進行數據處理及制圖。

2 結果與分析

2.1 艾草黃酮體外抗氧化試驗

2.1.1 總還原力 由圖1可知，在選定的濃度范圍內，隨著質量濃度的增大，黃酮純化物、抗壞血酸的吸光度皆變大，總體呈較好的線性關系，表明該物質具有一定的還原力，且吸光度值越大，總還原能力越強，其抗氧化性也越高。在同一質量濃度下，雖黃酮純化物總體較弱于抗壞血酸，但在一定濃度下，黃酮純化物可替代抗壞血酸。

表2 硫化氫檢驗的判斷標準

圖1 黃酮純化物、抗壞血酸的總還原力

圖2 黃酮純化物、抗壞血酸對的清除作用

2.1.3 對·OH的清除作用 由圖3可知，艾草黃酮純化物、抗壞血酸對·OH的清除率與質量濃度呈正相關。當質量濃度<0.2 mg/mL時，抗壞血酸清除率增幅較強于黃酮純化物；當質量濃度>0.2 mg/mL時，抗壞血酸清除率增幅減緩，黃酮純化物清除率增幅反而增大；當質量濃度為0.4 mg/mL 時，黃酮純化物對·OH的清除率達到77%，而抗壞血酸的清除率為74.5%，表明當質量濃度>0.4 mg/mL時，黃酮純化物對·OH的清除率大于抗壞血酸。

2.1.4 對DPPH·的清除作用 由圖4可知，在試驗濃度范圍內，不同質量濃度的艾草黃酮純化物與抗壞血酸對DPPH·的清除率均呈上升趨勢。當質量濃度<0.2 mg/mL 時，抗壞血酸對DPPH·的清除率增幅較強，而黃酮純化物對DPPH·的清除率增幅則較緩；當質量濃度為0.2～0.4 mg/mL 時，黃酮純化物清除率增幅高于抗壞血酸；當質量濃度>0.4 mg/mL時，抗壞血酸對DPPH·的清除率趨于平緩接近無增長，艾草黃酮對DPPH·的清除率增幅雖有所下降但仍表現出較強的DPPH·清除能力。

圖3 黃酮純化物、抗壞血酸對·OH的清除作用

圖4 黃酮純化物、抗壞血酸對DPPH·的清除作用

2.2 艾草黃酮應用于雞胸肉保鮮試驗

2.2.1 不同質量濃度艾草黃酮對肉樣pH值的影響 由圖5可知，整個貯藏期間，各組分pH值總體均呈上升趨勢，是由于肉中的蛋白質在微生物的作用下被分解成氨、三甲胺等堿性物質，促使pH值逐漸增大[17-18]。貯藏時間為0 d時，空白組與對照組pH值無顯著差異；貯藏2 d后，隨貯藏時間的延長，除空白對照組外，經艾草黃酮溶液處理后的樣品pH值增幅趨勢較緩，且質量濃度與pH值呈負相關，在一定程度上表明艾草黃酮提取液對冷卻肉的貯藏具有一定的抑菌作用和保鮮效果；貯藏4 d后，濃度0.5 mg/mL的艾草黃酮純化物處理液的pH值最低，表明在所考察的范圍內，艾草黃酮質量濃度越高，保鮮效果越好。

2.2.2 不同質量濃度艾草黃酮對肉樣感官品質的影響

由表3可知，貯藏過程中，對照組與處理組，其感官品質總體均隨時間的延長而降低。其中，空白對照組在整個貯藏期間感官品質變化最為明顯，其在第2天時，氣味開始變化，其余組分感官品質均無變化，隨著貯藏時間的增加，各處理組感官品質變化趨勢有所減緩。貯藏第8天時，空白對照組感官品質低于各處理組分，表明在貯藏期間艾草黃酮純化物在一定程度上抑制了冷卻肉感官品質的降低，達到一定的保鮮效果。

圖5 雞胸肉貯藏期間pH值變化

表3 艾草黃酮濃度對貯藏期間雞胸肉感官品質的影響

2.2.3 不同質量濃度艾草黃酮對肉樣TBARS值的影響

由圖6可知，相同貯藏時間內，添加組雞胸肉TBARS值均低于空白組，且隨著黃酮添加量增大，對應的雞胸肉TBARS值越小，表明艾草黃酮純化物具有一定的抗氧化作用，且隨質量濃度越大，抗氧化效果越佳。在0～8 d時，空白組、添加0.1，0.2，0.3 mg/mL的艾草黃酮純化物，對應雞胸肉TBARS值呈不斷上升趨勢，繼續延長貯藏時間，TBARS值下降并趨于平緩，可能是由于雞胸肉中的丙二醛作為氧化的中間產物被氧化為有機酸，導致丙二醛無法繼續與TBARS反應[19-20]。

2.2.4 不同質量濃度艾草黃酮對肉樣TVB-N值的影響

由圖7可知，處理組與空白對照組隨貯藏時間的延長，TVB-N值逐漸增加，可能是肉品被侵染或肉本身含有的微生物引起蛋白質脫羧、脫氨等作用產生堿性物質[21]。第4天，空白組、0.1 mg/mL處理組和0.2 mg/mL處理組的TVB-N值均已超過GB/T 9959.2—2008 限定值(15.00 mg/100 g)，表明雞胸肉開始出現腐敗變質現象，而0.3，0.4，0.5 mg/mL處理組均未超過國標限定值。第8天時，空白組TVB-N值達到39.08 mg/100 g，各黃酮純化物處理組顯著低于空白組，表明黃酮純化物在雞胸肉冷藏期間可抑制微生物與酶的作用，減緩其腐敗變質速度。整個貯藏過程中，肉中TVB-N值的總體變化趨勢為先緩慢增大后急劇增大，這主要是由于前期肌肉收縮產生的肌漿蛋白酶促進蛋白質水解，以及后期的微生物降解[22-23]；隨著黃酮純化物質量濃度的增大，揮發性鹽基氮含量增大的趨勢有所下降，且0.4 mg/mL處理組與0.5 mg/mL處理組無明顯差異。從綜合效益分析，選擇濃度為0.4 mg/mL的艾草黃酮純化物為最佳質量濃度。

圖6 雞胸肉貯藏期間TBARS值變化

圖7 雞胸肉貯藏期間TVB-N值變化

2.2.5 不同質量濃度艾草黃酮對肉樣紅度值的影響a值越大肉色越紅，表明肉類被氧化的程度較小[24]。由圖8 可知，各試驗組的紅度值在貯藏期間均逐漸減小。貯藏2 d 后，各處理組的紅度值均高于空白對照組，其變化趨勢也較空白對照組緩慢。整個貯藏期間，0.5 mg/mL處理組艾草黃酮純化物溶液的雞胸肉紅度值，其a值由原來的17.28變為10.65，下降了6.63；而空白對照組的a值由原來的15.13變為4.63，下降了10.50，其變化趨勢顯著高于黃酮純化物處理過的雞胸肉，表明艾草黃酮純化物有明顯延緩其色澤變化的效果。

2.2.6 不同質量濃度艾草黃酮對肉樣硫化氫檢驗的影響

由表4可知，整個貯藏期間，經艾草黃酮純化物處理的樣品能有效控制冷肉在冷藏過程中硫化氫的產生，表明艾草黃酮純化物在一定程度上可有效抑制冷卻肉的腐敗。

3 結論

體外抗氧化試驗表明，艾草黃酮純化物具有良好的體外抗氧化能力。艾草黃酮純化物有一定的還原力，且還原力隨著質量濃度的增大而增強，超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基均具有清除能力，但都弱于抗壞血酸。

圖8 雞胸肉貯藏期間紅度值變化

表4 雞胸肉貯藏期間硫化氫變化

雞胸肉各理化指標的檢測結果表明，艾草黃酮純化物對雞胸肉保鮮效果較強于空白對照組，可有效抑制雞胸肉中微生物的繁殖和脂質的氧化。艾草黃酮純化物多濃度梯度的保鮮對照試驗發現，當質量濃度為0.4 mg/mL 和0.5 mg/mL 時，艾草黃酮保鮮液對雞胸肉的保鮮效果無明顯差異。從生產效益成本分析，濃度過高導致成本增加，不適于生產應用，因此，艾草黃酮純化物的最佳質量濃度為0.4 mg/mL。艾草黃酮純化物可有效抑制雞胸肉中微生物生長速度，延緩腐敗等特征的產生，可作為天然抗氧化劑應用于食品加工及肉制品的保鮮。