曲霉菌對唑類藥物的耐藥機制最新研究進展

劉登科，牛虹博，葛正茂，劉宇鵬

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第967醫院ICU，遼寧大連 116000）

曲霉菌在自然界中分布廣泛且種屬眾多，在濕潤的土壤、谷類中都可存在[1-2]。其本身為條件致病菌，正常情況下不致病，但是當人體免疫功能下降時，即可侵入人體，造成侵襲性曲霉菌?。╥nvasiveAspergillosis,IA）[3]。因為IA的死亡率高、早期診斷率低[4-5]，所以針對曲霉菌的殺菌藥物就顯得尤為重要。目前，治療曲霉菌感染常用三類抗真菌藥物：多烯類、唑類和棘白菌素[6]，其中伏立康唑（voriconazole，VRC）被美國的最新指南推薦為曲霉菌病的一線治療藥物[7]。但越來越多的研究顯示，曲霉菌在世界范圍內對于唑類藥物的耐藥率逐漸升高，給臨床治療帶來極大困難，嚴重威脅了病患的生命安全[5-6]。由于多烯類藥物具有較強的毒性，棘白霉素類藥物的價格較為昂貴，因此唑類藥物是治療曲霉菌感染的一線藥物[8-9]，因此本文就曲霉菌對唑類藥物的耐藥機制的最新研究進展進行簡要闡述，以期為曲霉菌耐藥菌株的監測以及新型治療藥物作用靶點的研制提供理論基礎。

1 曲霉菌對唑類抗真菌藥物的耐藥機制

1.1 外排系統過表達將抗菌物質泵出菌體外 外排系統的過表達是曲霉菌對唑類藥物產生耐藥性的一種重要機制，相關作用基因主要是三磷酸腺苷結合盒蛋白(ATP - binding cassette transporter，ABC) 超家族和主要協同轉運蛋白(the major facilitator superfamily，MFS)超家族[10]。有關文獻顯示，釀酒酵母的PDR5和PDR15蛋白參與了釀酒酵母對唑類藥物的耐藥，而CHAMILOS等[11]人在煙曲霉中發現的12個ABC轉運蛋白與釀酒酵母的PDR5和PDR15蛋白同源，提示人們ABC轉運蛋白可能與煙曲霉對唑類的耐藥相關。到目前為止，已知的與耐唑相關的轉運蛋白有5個：AfuMDR1，AfuMDR2，AfuMDR3，AfuMDR4和AtrF。AfuMDR1和AfuMDR2 是最早被報道的ABC轉運蛋白，直接參與了煙曲霉對藥物的外泵作用[12]，而AtrF則是分離自對伊曲康唑(itraconazole，ITC)耐藥的臨床煙曲霉株，對ITC耐藥株中AtrF mRNA的表達水平是對ITC敏感株的5倍[13]。還有報道表明，對ITC耐藥菌株中轉運蛋白AfuMDR3和AfuMDR4的表達上調[14]；對泊沙康唑（posaconazole，POS）耐藥煙曲霉株中AfuMDR4 的表達上調[15]。MFS與AfuMDR3具有相似性，SUN等[16]人通過研究發現，MFS轉運蛋白Mdr1p可以通過細胞膜的質子梯度為轉運體提供能量，其過表達可導致曲霉菌對唑類藥物耐藥性的產生。然而，關于曲霉菌外排系統過表達將唑類藥物泵出菌體外的機制尚未研究透徹，還需要進一步詳細的研究。

1.2 曲霉菌生物膜的產生 曲霉菌的耐藥性可以通過生物膜的產生來調節，生物膜不僅可以在惡劣環境中保護病原體，還能引起暫時性的對抗真菌藥物的耐藥性[17-18]。此前MOWAT等[19]人在培養曲霉菌時發現其形成的生物膜結構對抗真菌藥物具有耐藥性，隨后BEAUVAIS等[20]人則報道了煙曲霉菌落表面的細胞外基質的作用。他們認為煙曲霉細胞外基質有助于菌絲結合在一起形成生物膜結構，阻止藥物擴散到真菌感染部位，從而降低了藥物敏感度。PAUL等[17]人也認為生物膜的形成是曲霉菌對抗真菌藥物的高最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的原因。此外，在生物膜結構中，多種耐藥蛋白被激活，也可通過主動外排系統泵出抗真菌藥物[15]。生物膜有關感染的死亡率極高，現有藥物治療難以治愈，因此對生物膜在耐藥性中的研究十分重要。

1.3 曲霉菌自身基因的改變

1.3.1 cyp51的突變與過表達：目前常用的抗真菌藥物的作用機理主要是通過干擾麥角固醇的生物合成來影響真菌細胞膜的形成[21]。自1997年首次報道煙曲霉唑類耐藥菌株以來，越來越多的人對其耐藥分子機制進行了探討[22]。在煙曲霉屬中，唑類藥物的目標是蛋白cyp51，它有兩個同源的基因編碼，即cyp51A和cyp51B，其序列一致性為63%，相關研究表明，大多數煙曲霉唑耐藥株的出現都與cyp51A的點突變有關[23]。在煙曲霉菌中羊毛甾醇 14-α-脫甲基酶由cyp51A編碼，是真菌細胞膜重要成分麥角固醇生物合成途徑的關鍵酶。唑類抗真菌藥中的氮原子可以結合位于cyp51A活性位點的血紅素的鐵原子上。通過這種方法，可以阻斷羊毛甾醇第14位碳原子的脫甲基作用，從而干擾麥角固醇的合成。缺乏麥角固醇會改變細胞膜的流動性，導致真菌細胞的死亡[5,24]。

如前所述，大多數耐唑類菌株cyp51A發生了改變，而cyp51B在煙曲霉耐唑類藥物菌株中的作用尚不清楚。近年來，也有相關研究報道了cyp51B在唑類耐藥臨床分離菌株中的作用[25]，BUIED等[26]人在所分離得到的12株煙曲霉臨床耐藥菌株中均發現了cyp51B的過表達。隨后他們對cyp51B過表達的菌株進行了基因敲除，又對唑類藥物敏感的菌株進行了cyp51B的過表達，驗證了cyp51B的過表達與曲霉菌對唑類藥物的耐藥有關這一發現。

1.3.2 hapE的突變：hapE是CCAAT結合轉錄因子復合物亞基，hapE的突變所引起的煙曲霉對唑類藥物耐藥是近年來發現的一種基因突變所致的耐藥機制[27]。這一發現由CAMPS等[28]人于2012年發現并提出，他們通過全基因組測序、聚合酶鏈式反應等多種方法證明了hapE中P88L的替換是導致煙曲霉對唑類藥物耐藥性產生的原因。hapE的突變會引起其與CCAAT復合物之間的親和力變低，而減少了功能性CCAAT結合轉錄因子復合物后又會造成曲霉菌致病力的減弱。GSALLER等[29]人進一步研究發現，CCAAT結合轉錄因子復合物作為調控麥角固醇合成的負作用因子，若其減少，將會解除包括cyp51在內的多種關于麥角固醇合成的基因轉錄水平的抑制，造成麥角固醇的增多和耐藥菌株的產生。

1.4 環境對耐藥株的產生和傳播 此外，環境對耐藥株的產生和傳播作用也不可忽視。多種唑類殺菌劑廣泛用于農作物的保護，這些唑類殺菌劑的分子結構與三唑類藥物相似，但曲霉菌并不是在農業中使用殺菌劑的目標病原體，曲霉菌在自然界分布廣泛，土壤、作物中都有其孢子的存在，因此用殺菌劑處理過的作物上的真菌暴露于高濃度的唑類物質中[5]，導致了耐藥株的產生和傳播[5,22,30]。截至目前，歐洲是煙曲霉對唑類藥物耐藥性最高的地區，其中基因型為TR34/L98H，TR46/Y121F/T289A的耐藥菌株已在歐洲各地發現，且被報道與農業殺菌劑的廣泛使用有關[22,31]。雖然對亞太地區報告表明，其三唑耐藥率低于歐洲，但也出現了部分新型耐藥菌株[30,32]，亞太地區和歐洲曲霉菌唑類藥物耐藥率的差異可能是由于亞洲國家對唑類殺菌劑的使用較少所致[5]。

1.5 其他作用導致的耐藥性的產生 熱休克蛋白90 (heat shock proteins90，Hsp90)是一種真核分子伴侶蛋白，可以在環境作用下調控蛋白的折疊、運輸和成熟[33]。鈣調神經磷酸酶不僅是Hsp90的沉默蛋白之一，還是鈣信號通路的重要組成部分，在對唑類藥物的耐藥性中也發揮著一定作用。有關實驗發現，抑制了鈣調神經磷酸酶后，煙曲霉對唑類藥物的耐藥性也隨之下降[5,9]。

外源性膽固醇在有氧條件可以作為麥角固醇的替代物，也是一種導致曲霉菌對唑類藥物產生耐藥的機制。體外實驗發現當培養基中存在膽固醇血清時，伊曲康唑對煙曲霉的作用活性降低[34]。另有研究發現，在煙曲霉中，一種固醇調節元件結合蛋白-SrbA可以通過erg11，cyp51A調節菌株對唑類藥物的耐藥性，而srbA的突變菌株(ΔsrbA)對氟康唑（Fluconazole，FLC）和VRC表現出高度敏感[35]。

2 討論

近年流行病學調查發現，曲霉菌感染率正呈逐年上升趨勢，再加上曲霉菌感染診斷率低，死亡率高的特點，對人類社會的健康造成了極大威脅[4-5]。目前，治療曲霉菌感染常用三類抗真菌藥物：多烯類、唑類和棘白菌素[6,9]。其中，唑類藥物廣泛用于曲霉菌感染的預防、經驗性治療以及慢性真菌感染的長期保守治療，其中VRC被推薦用作曲霉菌感染的一線治療方案[6-7,21]。但在過去的幾年間，世界各地均有煙曲霉對唑類藥物產生耐藥性的報道，且報道數量仍在不斷增加，所以對曲霉菌進行耐藥率和耐藥機制的研究就顯得尤為重要[9,21]。因此，對于以上情況，本文給與以下建議：由于抗菌劑在農業生產中的大規模使用，使得每個國家都應密切關注并調查最新耐藥株的流行情況，并依據調查結果在耐藥株發生率高的地區積極調整治療方案。實驗室則應對臨床曲霉菌分離株進行常規藥敏試驗，以便臨床醫生選擇最佳的抗真菌治療方案。而對于正在進行單唑類抗真菌藥物治療的患者，需進行密切監測，當發現唑類耐藥、臨床治療失敗時，應迅速調整新的治療方案，使之包括兩性霉素B，或在VRC中加入一種棘皮菌素?？偟膩碚f，有效的抗真菌管理對于控制耐藥性的產生至關重要，本文針對曲霉菌對唑類藥物的耐藥機制的最新研究進展作了簡要闡述，以期為曲霉菌耐藥菌株的監測以及新型治療藥物作用靶點的研制提供理論基礎，但耐藥性的研究是項大工程，仍有許多機制不夠明確，需要人類進一步探究。