卵圓細胞惡性轉化相關差異性甲基化基因的篩選及驗證

汪鑫，閆亮亮，安然，程亞，王恒毅

作者單位：安徽醫科大學第一附屬醫院，a急診外科，b 風濕免疫科，安徽 合肥230032

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最常見且惡性程度最高的腫瘤之一，占我國癌癥死亡率的第2位［1］。肝癌的發病機制仍不十分清楚。卵圓細胞（oval cell）是一類定植于膽管的核圓少漿的上皮細胞，在特定的疾病或病理生理條件下，可被激活并增殖［2-3］。其被認為是肝臟前體干細胞，具有腫瘤干細胞的特征。在致癌因素作用下，卵圓細胞高速增殖，基因組結構不穩，分化失控，繼而發育停滯，惡性轉化為肝癌細胞［4-5］。但卵圓細胞惡性轉化的調控機制仍未闡釋清楚。

我們將肝細胞癌基因HBV X（HBX）轉染大鼠肝卵圓細胞（LE6細胞系）后發現：轉染HBX卵圓細胞（HBX-LE6）發生了惡性轉化，在動物模型中，HBX-LE6細胞在肝內形成間質瘤細胞和肝癌細胞組成的肝癌肉瘤［6-7］，但致癌因素誘導卵圓細胞惡性轉化的表觀遺傳學機制尚未闡明。根據表觀遺傳致癌假說，致癌因素的暴露能改變細胞的表觀遺傳學模式，進而引起基因活性和細胞表型的改變，引發原癌基因的活化和腫瘤抑制基因滅活，最終導致腫瘤的發生。DNA甲基化（DNA methylation）是目前研究最為廣泛的表觀遺傳現象。低甲基化造成腫瘤細胞基因組的不穩定，并促使致癌基因活化。抑癌基因的高甲基化可以直接抑制其表達或基因沉默，引起細胞惡變，最終導致腫瘤的發生。

本研究于2017年1月至2018年5月首先利用簡化甲基化測序（Reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）對發生惡性轉化的卵圓細胞HBXLE6與正常LE6細胞進行甲基化測序，獲得差異性甲基化區域（Differentially methylated region，DMR），通過基因注釋獲得相關差異性甲基化基因（Differentially methylated gene，DMG），并進行驗證，探索DNA甲基化參與卵圓細胞惡性轉化的表觀遺傳學機制。

1 材料與方法

1.1材料卵圓細胞購于美國標準菌庫（馬納薩斯，弗吉尼亞州），TRIzol試劑盒購于美國Invitrogen公司，SYBR Green和HiScript IIQ RT SuperMix購于南京諾唯贊生物技術有限公司，qPCR引物核酸序列由上海生物工程有限公司合成，多克隆抗體和二級抗體均購于于北京博奧森生物公司，甲基化試劑盒和甲基化抑制劑5-Aza-CdR購于Zymo Research公司。

1.2方法

1.2.1 分組 HBX+LE6組：穩定表達HBX的惡性轉化后卵圓細胞；LE6組：正常大鼠卵圓細胞LE6；5-Aza-CdR+HBX-LE6組：培養基中加入5-Aza-CdR處理72 h后的HBX-LE6卵圓細胞。

1.2.2 高通量甲基化測序 通過Illumina HiSeqTMPE125/PE150系統獲得原始圖像，數據文件經CASAVA堿基識別（Base Calling）分析轉化為測序讀段（Sequenced Reads）。使用BiSeq軟件（1.6版）識別DMR。使用MethylKit軟件（1.0.0版）計算差值甲基化的P值。DMR標準閾值為P＜0.05，甲基化率差異大于10%。對DMR進行區域、基因注釋，獲得差異性甲基化相關基因及DMR在基因功能區域的定位。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈反應（Real-time qPCR）檢測 （1）反應體系：SybrGreen Mixture 12.5μL，互補DNA（cDNA）模板2.5μL，正向引物（10μmol/L）0.5μL，反向引物（10μmol/L）0.5μL，雙蒸餾水（ddH2O）9μL，總體積為25μL。（2）反應條件：95℃預變性2 min，95 ℃變性25 s，退火時間25 s，72 ℃延伸45 s，共45個循環。Real-time qPCR引物序列見表1。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測 以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參對照，細胞用細胞裂解液處理，在冰浴中勻漿。用BCA法蛋白定量。采用凝膠成像分析系統計算目的條帶的積分光密度、根據目的條帶的灰度值與內參照β-actin的灰度值之比值行定量分析。

表1 實時定量聚合酶鏈反應（Real-time qPCR）引物核酸序列

1.2.5 甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation specific polymerase chain reaction，MSP）檢測 （1）引物序列：甲基化特異性引物M-forward 5’-GTTCGTCGTCGT TTTTTAGGC-3’，和M-reverse5’-AAAAACCAACG ACCCCCGCG-3’，非甲基特異性引物為U-forward，U-forward5’-AGT TTGTTGTTGTTTTTTAGGTGG-3’，和 U-reverse 5’-AAAAAACCAACAA CCCCCACA-3’，擴增片段均為108 bp。（2）反應體系：10×PCR Buffer 2 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L dNTP）1.6μL，正向引物（10μmol/L）0.4μL，反向引物（10μmol/L）0.4μL，修飾后的DNA 2μL，DNA聚合酶0.1μL，去離子水13.5μL，總體積20μL。（3）反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，甲基化特異性引物58℃退火30 s，非甲基化特異性引物54℃30 s，然后72℃延伸30 s，共35個循環，最后72℃延伸6 min反應完成。

1.3統計學方法數據分析采用SPSS 17.0軟件，正態分布資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。對于DMR 的鑒定，采用軟件 BiSeq（1.6.0）、methylKit（1.0.0）進行檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1高通量甲基化測序結果HBX和HBX-LE6細胞共篩選出1 434個DMR。其中高甲基化623個（位于啟動子128個），低甲基化811個（位于啟動子216個）。通過DMR基因注釋，共篩選DMG 1 987個。并按統計顯著性排序，列出了前20位明顯高甲基化DMR和DMG，見表2。

2.2 Real-time qPCR檢測結果SMARCB1、CYLD、ZBTB16、USP18在HBX-LE6組中的mRNA表達量相對值較LE6組均顯著下調。SMARCB1高甲基化被5-Aza-CdR抑制后，5-Aza-CdR+HBX-LE6組中的mRNA表達較抑制前HBX-LE6組顯著上調（P＜0.05）。見表3，4。

表4 LE6、HBX-LE6和5-Aza-CdR+HBX-LE6三組中SMARCB1、CYLD、ZBTB16、USP18的相對表達量比較/

表4 LE6、HBX-LE6和5-Aza-CdR+HBX-LE6三組中SMARCB1、CYLD、ZBTB16、USP18的相對表達量比較/

注：HBX-LE6為轉染肝細胞癌基因HBV X（HBX）發生惡性轉化的大鼠肝卵圓細胞，LE6為正常大鼠肝卵圓細胞，5-Aza-CdR+HBXLE6為培養基中加入5-Aza-CdR處理72h后的HBX-LE6卵圓細胞，SMARCB1為SWI/SNF染色質重塑復合物，CYLD為腫瘤抑制因子，ZBTB16為含16的鋅指和BTB結構域蛋白，USP18為泛素特異性蛋白酶18基因。與HBX-LE6組比較，aP＜0.05

USP18 4.50±0.43 2.09±0.18 2.09±0.13 0.300 0.724組別LE6 HBX-LE6 5-Aza-CdR+HBX-LE6 F值P值重復次數3 3 3 SMARCB1 7.34±0.11 2.57±0.29 7.31±0.12a 4 018.000＜0.001 CYLD 7.30±0.27 3.44±0.13 3.5±0.08 0.138 0.874 ZBTB16 7.01±0.06 1.29±0.32 1.33±0.09 0.600 0.586

表2 轉染肝細胞癌基因HBV X（HBX）發生惡性轉化的大鼠肝卵圓細胞HBX-LE6與正常大鼠肝卵圓細胞LE6間位于啟動子差異性高甲基化區域列表（前20位）

表3 實時定量聚合酶鏈反應（Real-time qPCR）分別檢測HBX-LE6與LE6兩組中USP18、MAP3K6、SMARCB1、EGFR、CYLD、RNF39、ZBTB16、HOXD8的mRNA相對表達量/

表3 實時定量聚合酶鏈反應（Real-time qPCR）分別檢測HBX-LE6與LE6兩組中USP18、MAP3K6、SMARCB1、EGFR、CYLD、RNF39、ZBTB16、HOXD8的mRNA相對表達量/

注：HBX-LE6為轉染肝細胞癌基因HBV X（HBX）發生惡性轉化的大鼠肝卵圓細胞，LE6為正常大鼠肝卵圓細胞，RNF39為環指蛋白39，SMARCB1為SWI/SNF染色質重塑復合物，MAP3K6為有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶6，EGFR為表皮生長因子受體，HOXD8同源異型盒基因D8，CYLD為腫瘤抑制因子，ZBTB16為含16的鋅指和BTB結構域蛋白，USP18為泛素特異性蛋白酶18基因

USP18 4.50±0.43 2.09±0.18 6.848 0.021 LE6 HBX-LE6 t值P值3 3 5.00±0.02 4.95±0.03 2.186 0.094 7.34±0.11 2.57±0.29 34.860 0.001 7.30±0.12 7.31±0.07 0.230 0.829 7.44±0.01 7.41±0.02 2.219 0.091 8.56±0.08 8.46±0.02 2.249 0.088 7.30±0.27 3.44±0.13 32.180 0.001 7.01±0.06 1.29±0.32 33.620 0.001組別 重復次數RNF39SMARCB1MAP3K6EGFRHOXD8CYLDZBTB16

2.3蛋白質印跡法檢測結果USP18、ZBTB1、CYLD的蛋白表達在三組間差異無統計學意義（P＞0.05）。與LE6相比，SMARCB1在HBX-LE6中的蛋白表達下調，SMARCB1高甲基化被5-Aza-CdR抑制后，其蛋白表達顯著上調（P＜0.001）。見圖1、表5。

圖1 蛋白質印跡法檢測5-Aza-CdR+HBX-LE6、HBX-LE6、LE6三組中ZBTB16、CYLD、SMARCB1、USP18的蛋白表達

表5 LE6、HBX-LE6、5-Aza-CdR+HBX-LE6三組中SMARCB1、CYLD、ZBTB16、USP18的蛋白表達比較/

表5 LE6、HBX-LE6、5-Aza-CdR+HBX-LE6三組中SMARCB1、CYLD、ZBTB16、USP18的蛋白表達比較/

注：LE6為正常大鼠肝卵圓細胞，HBX-LE6為轉染肝細胞癌基因HBV X（HBX）發生惡性轉化的大鼠肝卵圓細胞，5-Aza-CdR+HBX-LE6為培養基中加入5-Aza-CdR處理72h后的HBX-LE6卵圓細胞，SMARCB1為SWI/SNF染色質重塑復合物，CYLD為腫瘤抑制因子，ZBTB16為含16的鋅指和BTB結構域蛋白，USP18為泛素特異性蛋白酶18基因。與LE6組比較，aP＜0.01；與HBX-LE6組比較，bP＜0.01

USP18 8.45±0.21 8.32±0.14 8.29±0.19 11.734 0.075組別LE6 HBX-LE6 5-Aza-CdR+HBX-LE6 F值P值重復次數3 3 3 SMARCB1 6.26±0.25 1.53±0.34a 7.55±0.32b 34 309.000＜0.001 CYLD 1.62±0.22 1.58±0.17 1.72±0.23 10.331 0.082 ZBTB16 4.33±0.03 4.31±0.15 4.29±0.09 2.400 0.172

2.4 MSP檢測5-Aza-CdR+HBX-LE6、HBX-LE6和LE6三組中SAMRCB1基因的甲基化狀態分別用“M”（甲基化特異性引物）和“U”（非甲基化特異性引物）進行擴增。LE6、HBX-LE6用U引物擴增都有特異性擴增產物，M引物僅在HBX-LE6有特異性擴增產物。在5-Aza-CdR干預后，5-Aza-CdR+HBXLE6中U引物有特異性擴增產物，M引物無特異性擴增產物。見圖2。

圖2 甲基化特異性聚合酶鏈反應（MSP）檢測LE6、HBX-LE6和5-Aza-CdR+HBX-LE6三組中SWI/SNF染色質重塑復合物（SMARCB1）基因的甲基化狀態

3 討論

DMR指在不同樣本之間，甲基化修飾水平具有顯著差異的基因組區域，這些區域在基因表達調控方面發揮重要作用。本研究結果共獲得DMR 1 434個，其中高甲基化DMR 623個（位于啟動子128個），低甲基化DMR 811個（位于啟動子216個）。通過DMR基因注釋獲得DMG 1 987個。從中挑選出高甲基化相關基因 USP18、MAP3K6、SMARCB1、EGFR、CYLD、RNF39、ZBTB16、HOXD8進行驗證。結果表明：CYLD、ZBTB16、USP18在HBX-LE6中的mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）。已知USP18與肺癌關系密切，改變USP18水平會影響肺癌細胞cyclinD1蛋白的穩定性［8］。ZBTB16蛋白含有一個鋅指結構和一個BTB結構，被認為與調控細胞自噬有關［9］。CYLD被認為是抑癌基因，其去泛素化活性調控NF-κb及JNK等信號途徑，在抑制腫瘤方面發揮重要作用［10］。在5-Aza-CdR抑制其甲基化后，三種基因mRNA表達水平并未明顯上調。表明啟動子高甲基化并非其mRNA表達下調的單一因素。USP18、ZBTB1、CYLD的蛋白表達在兩組間差異無統計學意義（P＞0.05），可能與基因轉錄后水平、翻譯水平等多重調控有關。

與LE6相比，SMARCB1在HBX-LE6中的蛋白表達顯著下降（P＜0.05），與其mRNA表達水平下調一致。進一步研究表明，5-Aza-CdR完全抑制了SMARCB1啟動子的甲基化，且抑制后HBX-LE6細胞中SMARCB1的mRNA與蛋白表達均顯著升高（P＜0.05），表明啟動子的高甲基化可能是下調抑癌基因SMARCB1表達的主要因素。SMARCB1基因編碼的蛋白是ATP依賴性染色質調節復合物SWI/SNF的核心亞基，參與基因的表觀修飾和轉錄調控［11］。SMARCB1基因突變與多種腫瘤的發生相關，其作為抑癌基因可以誘導細胞G1停滯、抑制染色體非整倍性等發揮腫瘤抑制的作用［12-13］。SMARCB1與肝癌發生的關系密切。SMARCB1在肝組織中的表達與肝癌發生的風險呈負相關。敲除SNF5（SMARCB1/INI1/BAF47）的肝癌細胞系Hep3B和HCCLM3生長和遷移能力明顯增強［14-16］。

表觀遺傳學認為，表觀遺傳改變在腫瘤發生發展過程中起著主要作用，是細胞惡性轉化早期的主要驅動力［17］。在哺乳動物基因組中，DNA甲基化的主要位點是CpG二核苷酸，常位于基因上游調控區的啟動子區域。啟動子區的CpG島通常處于非甲基化狀態，基因能正常表達；當其發生甲基化時，影響基因轉錄調控，使基因表達發生沉默。因此，抑癌基因SMARCB1啟動子的高甲基化可能參與了LE6卵圓細胞發生惡性轉化的分子機制。但其下游靶基因或效應分子為何，以及在體內如何影響卵圓細胞的生物學特征均需進一步深入研究。

綜上所述，本研究應用RRBS技術，獲得轉化后大鼠卵圓細胞與未轉化卵圓細胞的DMR與DMG，并對相關基因進行驗證，為研究卵圓細胞發生惡性轉化的表觀遺傳學機制提供了重要線索與理論依據。