慢病毒介導酪氨酸激酶受體A過表達載體促進神經干細胞增殖和分化的實驗研究

鄧明，謝萍，馬永剛，周炎，賀斌，陳慶，吳飛，陳忠輝，明江華

作者單位：1武漢大學人民醫院骨科，湖北 武漢430060；2武漢市第三醫院中醫科，湖北 武漢430060

脊髓損傷是臨床上常見的中樞神經系統的損傷，多由高能量損傷引起，比如車禍傷，高處墜落傷等［1-2］。脊髓損傷具有較高的致殘率，是臨床上的治療難點，雖然治療方式很多，但是效果一直不理想［3］。因此，尋找一種安全有效的治療方案是十分必要的。神經干細胞可以從小鼠的紋狀體和脊髓中獲得，因其多分化潛能一直備受人們的關注［4-5］。也有學者將神經干細胞直接注射入小鼠脊髓損傷模型中，但是修復效果不理想，原因可能有二，第一，神經干細胞數量較少，增殖能力較弱；第二就是分化能力差，神經干細胞分化的神經元細胞功能較差，不能滿足需要［6-7］。所以尋找一種促神經干細胞增殖和分化的方案是臨床需求所在。

酪氨酸激酶受體A（Tyrosine kinase receptor A，Trk A）與神經元細胞的存活和分化密切相關［8］，在海馬、新皮質等部分均可以檢測到Trk A的表達，而且含量較高［9-10］。也有研究證明，Trk A與大腦的記憶功能密切相關［11］。因此，本研究于2018年1月至2019年1月通過siRNA技術構建Trk A的過表達載體，通過慢病毒進行轉染神經干細胞，觀察其對神經干細胞促增殖和分化作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料改良Eagle培養基（DMEM）培養基和Hank’s液均購于美國Gibco公司；胎牛血清（FBS）購于以色列BI公司；兔抗鼠Brdu及Nestin單克隆抗體購于Abcam公司；慢病毒的提取和Trk A的過表達載體的構建由上海吉凱公司提供；MTT試劑盒購于Trizol提取試劑盒，Takara逆轉錄試劑盒和Takara熒光定量PCR試劑盒購于日本Takara公司；AV-PI試劑盒購于聯科生物有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 神經干細胞的提取和培養 取新生SD雌性大鼠10只，體質量（23.0±3.2）g，月齡為（4.4±0.8）月，符合SPF清潔級動物指標，動物合格證號：2009A047，購于濟南動物實驗研究中心，許可證號：SCXK魯20190001。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。常規消毒后，采用斷頸法處死SD大鼠，眼科剪分離SD大鼠腦組織，取海馬組織，Hank’s液清洗3遍，研磨棒研磨均勻，加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS溶液），制備細胞懸液，4℃低溫高速離心機16 000 r/min離心5 min，取沉淀物，加入含20%FBS的DMEM培養基，制備細胞懸液，接種于25 mL的無菌培養瓶中。置入37℃、體積分數5%二氧化碳下培養，3 d換液1次，待細胞融合率達80%以上時進行細胞傳代。

1.2.2 神經干細胞的鑒定 本研究采用免疫熒光的方法對神經球進行鑒定，取第3代神經干細胞，胰蛋白酶消化后加入含20%FBS的DMEM培養基，對胰蛋白對進行拮抗，普通離心機5 000 r/min離心5 min，取沉淀物，加入含20%FBS的DMEM培養基，制備細胞懸液，接種于24孔玻璃板中，待細胞融合率為50%左右時，去掉培養基，PBS溶液清洗3遍，加入5%甲醛溶液固定20 min，PBS溶液清洗3遍，加入20%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）進行透膜處理，PBS溶液清洗3遍，加入兔抗鼠Brdu及Nestin單克隆抗體，避光4℃過夜處理（＞12h），PBS溶液清洗3遍，加入含CY3（紅色）和GFP（綠色）熒光二抗，避光孵育30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 Trk A的過表達載體的構建 Trk A的過表達載體的構建和篩選由上海吉凱公司完成。首先對目的基因進行過表達引物設計，設計序列為：TrkA（4589-11）：P1：ACGGGACTAAGCGCATTGCAATTTCC；Trk A（4589-11）：P2：GAATCGCGTTGCATGCCGTAA。然后RT-PCR擴增目的基因序列，將目的基因擴增序列加入線性化表達載體，選取上海吉凱公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒載體作為酶切對象，加入Trk A基因過表達載體序列后，轉染人胚腎293T細胞，進行克隆測定，然后進行質粒的抽提，慢病毒的包裝以備用。

1.2.4 實驗分組 將神經干細胞分成三組，即空白對照組，陰性對照組和實驗組。空白對照組為未做任何處理的細胞組，陰性對照組是經空白載體的慢病毒轉染的細胞組，實驗組是由Trk A的過表達載體構建的慢病毒轉染細胞組。

1.2.5 逆轉錄PCR（RT-PCR）檢測Trk A和神經分化基因Tuj1、GFAP、CNPase的表達 利用胰蛋白酶收集上述各組細胞（空白對照組，陰性對照組和實驗組），經PBS溶液清洗3次，常溫離心機1 500 r/min離心5 min，取沉淀，加入1 mL Trizol溶劑，提取細胞總RNA，保證RNA純度范圍為1.8～2.1，然后利用Takara逆轉錄試劑盒的要求，采用20μL反應體系逆轉錄為互補DNA（cDNA），-80℃保存，采用Takara熒光定量PCR試劑盒（SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒）的要求，采用FTC-2000 RT-PCR系統和50μg反應體系對樣本DNA進行分析，溶解曲線確定Tm值為53.7℃，統計并記錄各組樣本的CT值，采用2-△△CT法對 Trk A 和神經分化基因 Tuj1，GFAP 和CNPase的表達進行統計。Trk A，Tuj1，GFAP，CNPase和內參基因GAPDH引物設計由上海生工公司設計并檢測合格（表1）。

表1 酪氨酸激酶受體A（Trk A）、神經分化基因Tuj1、GFAP、CNPase和內參基因GAPDH引物序列

1.2.6 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測Trk A，Tuj1，GFAP和CNPase的蛋白表達 慢病毒轉染72 h后，收集上述三組細胞，棄掉培養基后，PBS清洗后，加入2 mL RIPA細胞裂解液，冰上孵育45 min，細胞刮收集細胞碎片，加入PE管中，預冷高速離心機，4℃，12 000 r/min，收集總蛋白，加入10μL苯甲基磺酰氟（PMSF），99℃煮沸，BAD試劑盒測定蛋白的分子量。按照說明書，配置10%分離膠和4%濃縮膠，加入50 ng蛋白量，1×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液浸沒膠板，40 V電泳2 h后轉染到硝酸纖維素膜，等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜后，過夜孵育Trk A、Tuj1、GFAP和CNPase的蛋白一抗，TBST液洗膜，常溫孵育鼠抗山羊辣根過氧化物酶（HRP）二抗30 min，DAB顯影，Image J軟件分析蛋白條帶。

1.2.7 CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖 利用胰蛋白酶收集上述各組細胞（空白對照組，陰性對照組和實驗組），經PBS溶液清洗3次，常溫離心機1 500 r/min離心5 min，取沉淀，加入含20%FBS的DMEM培養基5 mL，制成細胞懸液。接種在96孔板中，以每孔5 000個/100微升的接種量接種，按照CCK-8試劑盒的說明書，72 h后每孔加入10μL的CCK-8的試劑，放到37℃，5%二氧化碳濃度的細胞培養箱中培養2 h。使用酶標儀，在450 nm波長處測定吸光度，每組設置3個復孔。

1.3統計學方法應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，結果用形式表示。三組比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1神經干細胞的培養和鑒定結果懸浮培養細胞5 d后，形成神經細胞球；免疫熒光染色顯示神經干細胞細胞球Nestin（紅色熒光），Brud染色（綠色熒光）陽性，且占細胞量的90%以上；熒光雙標染色（棕色熒光）顯示雙染細胞量占總細胞量的90%以上，說明培養的細胞是神經干細胞。見圖1。

2.2 Trk A過表達載體的構建和慢病毒轉染以綠色熒光蛋白（GFP）為熒光探針，完成Trk A過表達慢病毒載體的構建。慢病毒轉染效率較高，以人胚腎293T細胞為實驗對象，慢病毒轉染率如圖2所示。慢病毒滴度的檢測結果：Trk A過表達慢病毒載體轉染滴度為3×108TU/mL。

2.3 RT-PCR檢測Trk A與神經干細胞分化標志分子的mRNA表達空白對照組和陰性對照組的Trk A與神經分化標志分子Tuj1、GFAP和CNPase的mRNA相對表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05），而實驗組的Trk A與神經分化標志分子的mRNA相對表達量要明顯高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 逆轉錄PCR（RT-PCR）檢測酪氨酸激酶受體A（Trk A）與神經干細胞分化標志分子的mRNA表達/

表2 逆轉錄PCR（RT-PCR）檢測酪氨酸激酶受體A（Trk A）與神經干細胞分化標志分子的mRNA表達/

注：與空白對照組比較，aP＞0.05；與空白對照組比較，bP＜0.05；與陰性對照組比較，cP＜0.05

CNPase 1.27±0.05 1.12±0.07a 4.69±0.76bc 9.98 0.012組別空白對照組陰性對照組實驗組F值P值重復次數3 3 3 Trk A 1.09±0.09 1.11±0.05a 7.12±1.32bc 10.91 0.009 Tuj1 1.12±0.04 1.19±0.06a 3.26±0.98bc 14.23＜0.001 GFAP 1.15±0.07 1.11±0.05a 10.34±2.56bc 18.45＜0.001

2.4蛋白質印跡法檢測Trk A與神經干細胞分化標志分子的蛋白表達空白對照組和陰性對照組Trk A以及神經分化標志分子Tuj1，GFAP和CNPase的蛋白表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05），實驗組Trk A以及神經分化標志分子的蛋白表達量要明顯高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）。見圖3、表3。

2.5神經干細胞的增殖能力比較結果CCK-8試劑盒檢測結果表明，空白對照組、陰性對照組和實驗組的細胞增殖率分別為（87.92±9.21）%、（88.22±9.37）%、（176.01±11.33）%（F＝18.45，P＝0.001），其中空白對照組和陰性對照組的細胞增殖率比較差異無統計學意義（P＞0.05），實驗組的細胞增殖率要明顯高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）。

表3 蛋白質印跡法檢測酪氨酸激酶受體A（Trk A）與神經干細胞分化標志分子的蛋白相對表達量/

表3 蛋白質印跡法檢測酪氨酸激酶受體A（Trk A）與神經干細胞分化標志分子的蛋白相對表達量/

注：與空白對照組比較，aP＞0.05；與空白對照組比較，bP＜0.05；與陰性對照組比較，cP＜0.05

CNPase 147.29±37.87 155.45±29.86a 398.14±30.55bc 37.12＜0.001組別空白對照組陰性對照組實驗組F值P值重復次數3 3 3 Trk A 121.12±22.45 128.19±21.33a 476.18±19.32bc 20.76＜0.001 Tuj1 67.12±9.13 70.13±9.08a 95.14±6.22bc 29.78＜0.001 GFAP 109.18±34.09 111.17±38.21a 698.39±20.22bc 30.27＜0.001

3 討論

在本研究中，主要著眼于神經干細胞的增殖和分化研究，利用siRNA技術構建Trk A的過表達載體，利用慢病毒轉染技術，轉染神經干細胞，觀察其對神經干細胞的增殖和分化作用，此為本研究的創新點。

神經干細胞治療脊髓損傷是非常有前景的治療方案，相較于手術和藥物治療，具有明顯的優勢。神經干細胞對于脊髓損傷的修復具有十分重要的作用［12］。但是神經干細胞的增殖能力弱［13］，分化能力差［14］，單純的神經干細胞移植對于脊髓損傷的修復作用并不理想。神經干細胞治療脊髓損傷利用神經干細胞的增殖和分化，促進神經干細胞原位增殖和分化，根據損傷部位的功能需求和周圍內環境的要求，神經干細胞可以定向分化為神經元細胞，星形膠質細胞和少突膠質細胞等，從而更好地對脊髓功能進行修復［15-16］。本研究以神經干細胞為研究對象，通過取新生SD大鼠的海馬組織，提取和培養神經干細胞，以Nestin和Brud染色［17-18］對神經干細胞進行鑒定，結果證明我們提取的是神經干細胞。然后我們進一步尋找新的方法促進神經干細胞的增殖和分化。

Trk A與神經元細胞的存活和分化密切相關，在海馬、新皮質等部分均可以檢測到Trk A的表達，而且含量較高［19］。幾乎所有的膽堿能神經元都含有Trk A，所以Trk A在膽堿能神經元的分化和成熟過程中起到一定的作用［20］。也有研究證明Trk A與神經生長因子（NGF）相結合，共同促進了神經細胞的再生和干細胞的分化［21］。可見Trk A的表達量增多可以促進神經元細胞的增殖和分化。既往文獻表明，Tuj1蛋白是神經元細胞的標志物，GFAP是星形膠質細胞的標志物，CNPase是少突膠質細胞的標志物［22-23］。本研究利用siRNA技術，構建Trk A的過表達載體，通過慢病毒轉染神經干細胞，目的是通過促進神經干細胞內Trk A的過表達，觀察其生物學行為，結果證明，Trk A的過表達載體不僅可以促進Trk A mRNA水平的表達，還可以促進神經干細胞分化標志分子Tuj1，GFAP和CNPase的表達，從而促進神經干細胞向神經元細胞，星形膠質細胞和少突膠質細胞分化。另外，本研究也通過CCK-8試劑盒檢測了神經元干細胞的增殖，結果表明，Trk A的過表達載體也可以促進神經干細胞的增殖，從而解決了神經元干細胞的增殖能力低下的問題，為神經元干細胞用于脊髓損傷的治療提供了更多的依據和方案。

然而本研究尚有不足，Trk A過表達載體可以促進神經元干細胞的分化和增殖，但涉及的信號通路機制尚不明確，這也是本研究以后將要進行的工作。

綜上所述，Trk A過表達載體可以促進神經元干細胞向神經元細胞，星型膠質細胞和少突膠質細胞的分化，并且可以促進神經元干細胞的增殖。

（本文圖1～3見插圖12-3）