微小RNA-204-3p通過靶向調控Krüppel樣因子6對高糖誘導小鼠足細胞損傷的保護作用

常杰

作者單位：河南大學第一附屬醫院全科醫學科，河南 開封475000

糖尿病腎病是一種進行性腎病，由糖尿病微血管并發癥引發，常常導致終末期腎病［1］，嚴重影響病人的生活質量。足細胞是一種終末分化細胞，附在腎小球基底膜外表面，維持腎小球基底膜完整性［2］。資料顯示，足細胞是糖尿病腎病重要的早期靶細胞［3］，在糖尿病腎病進展中起著關鍵作用［4］，因此，研究足細胞凋亡可能為糖尿病腎病提供一種新的治療策略。微小 RNAs（MicroRNAs，miRNAs/miR）是一類內源性非編碼小RNA，參與細胞增殖、凋亡、周期、分化等多種生物學過程。越來越多的證據表明，miRNAs與糖尿病腎病發病機制有關，可作為診斷、預后及治療的生物標志物［5-7］。微小RNA-204-3p（MicroRNA-204-3p，miR-204-3p）在高糖誘導的足細胞中表達下調，可以抑制高糖導致的足細胞凋亡［8］，但miR-204-3p是否通過靶向調控鋅指蛋白Krüppel樣因子 6（Krüppel-like factor 6，KLF6）表達來影響高糖誘導的小鼠足細胞損傷，這方面的研究尚未見諸報道。因此，本研究通過體外細胞實驗，探討miR-204-3p是否通過靶向調控KLF6從而影響高糖刺激的小鼠足細胞損傷，旨在闡明其作用機理。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器小鼠腎臟足細胞系MPC5購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，RPMI-1640培養基購于美國Gibco公司，胎牛血清、胰酶、D-葡萄糖、γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）購于Sigma公司，Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司，miR-204-3p、si-KLF6、熒光素酶報告載體購于上海吉瑪生物有限公司，逆轉錄試劑盒、實時定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒購于美國應用生物系統公司，肌動蛋白微絲偶聯蛋白（synaptopodin）抗體、結蛋白（desmin）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、KLF6抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved-caspase-3）抗體、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體購于美國Cellular Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標記二抗、凋亡試劑盒購于上海碧云天生物技術研究所，ELC化學發光試劑盒購于美國Thermo公司。細胞培養箱購于美國Thermo公司，7500實時定量PCR儀購于美國ABI公司，倒置顯微鏡購于日本Olympus公司，酶標儀購于德國Eppendorf公司，BD FACSCalibur流式細胞儀購于美國BD公司。

1.2細胞培養MPC5細胞培養依據Li等［9］的方法，細胞中加入含10%胎牛血清、10 U/mL IFN-γ、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養液，在33℃、5%二氧化碳培養箱中培養。待MPC5細胞融合至80%，按1∶2～1∶3的比例接種傳代。誘導足細胞分化時，將MPC5細胞轉入不含IFN-γ的培養液，置37℃孵育2周。實驗前，血清饑餓24 h以同步化細胞。

1.3細胞分組與轉染收集MPC5細胞，加入D-葡萄糖進行干預，將細胞按隨機數字表法分為正常對照組（NG組，D-葡萄糖5 mmol/L），高糖刺激組（HG組，D-葡萄糖30 mmol/L），miR-204-3p過表達組（HG+miR-204-3p組和HG+miR-NC組，miR-204-3p或miR-NC轉染高糖刺激組細胞），抑制KLF6表達組（HG+si-KLF6組和HG+si-NC組，si-KLF6或si-NC轉染高糖刺激組細胞），KLF6過表達組（HG+miR-204-3p+pcDNA-KLF6組和HG+miR-204-3p+pcDNA組，miR-204-3p和pcDNA-KLF6或miR-204-3p+pcDNA共轉染高糖刺激組細胞），培養48 h。細胞轉染時，按照Lipofectamine 2000試劑說明書步驟，將miR-204-3p、si-KLF6、pcDNA-KLF6及各自對照轉染入MPC5細胞，并培養48 h備用。

1.4 qPCR檢測目的基因表達提取MPC5細胞總RNA，合成互補DNA（cDNA），以制成的cDNA為模板，檢測各組細胞中miR-204-3p與KLF6 mRNA水平。在實時定量PCR儀中進行反應，條件設置為95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40個循環后檢測擴增曲線和熔解曲線，收集Ct值，以2-ΔΔCt法進行分析，計算miR-204-3p與KLF6 mRNA相對表達量。

1.5蛋白質印跡法（Western Blot）檢測目的蛋白表達為檢測目的蛋白表達，在細胞中加入RIPA裂解液充分提取總蛋白，蛋白與上樣緩沖液混勻，沸水變性10 min，后經10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分離后轉移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，以一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）充分洗膜，室溫下用辣根過氧化物酶標記二抗（1∶2 000）孵育1 h，TBST充分洗膜，ECL進行顯色、顯影，拍照，以GAPDH作為內參蛋白，計算蛋白相對表達量。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡收集MPC5細胞，加入胰酶消化，將細胞密度調整為1×105/mL，加入500μL膜聯蛋白V（Annexin V）緩沖液重懸細胞，加入5μL Annexin V-異硫氰酸熒光素（FITC）和5μL碘化丙啶（PI），于室溫黑暗條件孵育30 min，上流式細胞儀評估細胞凋亡率。

1.7靶基因預測及雙熒光素酶報告基因利用生物 信 息 學 軟 件 TargetScan（http：//www.targetscan.org/）預測 KLF6的 3’非翻譯區（3’untranslated region，3’UTR）中含有與miR-204-3p互補的核苷酸序列，構建野生型（WT-KLF6）和突變型（MUT-KLF6）KLF6的3’UTR熒光素酶報告基因載體，并分別共轉染miR-204-3p或anti-miR-204-3p，培養48 h后，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒步驟測定雙熒光素酶活性。

1.8統計學方法每個獨立實驗均重復3次，結果以表示，采用SPSS 22.0軟件對實驗數據進行整理分析，采用兩獨立樣本t檢驗比較兩組間數據差異，采用單因素方差分析比較多組數據間差異，采用SNK-q檢驗比較組間多重差異，P＜0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-204-3p和KLF6在高糖誘導的小鼠足細胞中的表達HG組高糖誘導的小鼠足細胞MPC5中miR-204-3p表達量較NG組顯著降低（P＜0.05），KLF6 mRNA和蛋白表達量明顯提高（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 蛋白質印跡法檢測KLF6在高糖誘導小鼠腎臟足細胞中的表達

表1 miR-204-3p和KLF6在高糖誘導小鼠腎臟足細胞中的表達/

表1 miR-204-3p和KLF6在高糖誘導小鼠腎臟足細胞中的表達/

注：miR-204-3p為微小RNA-204-3p，KLF6為鋅指蛋白Krüppel樣因子6，NG組為正常對照組，HG組為高糖刺激組

KLF6蛋白0.46±0.04 0.89±0.08 14.423＜0.001組別NG HG t值P值重復次數3 3 miR-204-3p 1.02±0.08 0.41±0.04 20.460＜0.001 KLF6 mRNA 1.03±0.08 2.86±0.27 19.496＜0.001

2.2 miR-204-3p過表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞中synaptopodin和desmin表達的影響蛋白質印跡法檢測結果顯示，相比于NG組，HG組小鼠腎臟足細胞MPC5中miR-204-3p和synaptopodin蛋白表達量顯著降低，desmin表達量明顯升高（P＜0.05）。相比于HG+miR-NC組，miR-204-3p過表達大幅增加高糖刺激的小鼠腎臟足細胞MPC5中miR-204-3p表達量（P＜0.05），表明轉染成功。miR-204-3p過表達明顯提高高糖刺激的小鼠腎臟足細胞MPC5中synaptopodin蛋白水平，降低desmin蛋白水平（P＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 蛋白質印跡法檢測miR-204-3p過表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞中synaptopodin和desmin表達的影響

2.3 miR-204-3p過表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞凋亡的影響與NG組比較，HG組小鼠腎臟足MPC5細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達量明顯降低，Bax蛋白與cleaved-caspase-3蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）。與HG+miR-NC組比較，miR-204-3p過表達小鼠腎臟足MPC5細胞凋亡率顯著減少（P＜0.05），明顯提高Bcl-2蛋白水平而降低Bax蛋白與cleaved-caspase-3蛋白水平（P＜0.05）。見圖3、表3。

表2 miR-204-3p過表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞中synaptopodin和desmin表達的影響/

表2 miR-204-3p過表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞中synaptopodin和desmin表達的影響/

注：miR-204-3p為微小RNA-204-3p，synaptopodin為肌動蛋白微絲偶聯蛋白，desmin為結蛋白，NG為正常對照組，HG為高糖刺激組，HG+miR-NC為高糖刺激后給予miR-204-3p陰性對照（miR-NC）干預組，HG+miR-204-3p為高糖刺激后給予miR-NC干預組miR-204-3p干預。與NG組比較，aP＜0.05；與HG+miR-NC組比較，bP＜0.05

desmin蛋白0.34±0.03 0.81±0.07a 0.83±0.08 0.41±0.04b 174.500＜0.001組別NG HG HG+miR-NC HG+miR-204-3p F值P值重復次數3 3 3 3 miR-204-3p 1.00±0.09 0.32±0.03a 0.34±0.04 0.86±0.08b 261.176＜0.001 synaptopodin蛋白0.76±0.07 0.34±0.03a 0.32±0.03 0.67±0.06b 177.641＜0.001

表3 miR-204-3p過表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞凋亡及其相關蛋白表達的影響/

表3 miR-204-3p過表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞凋亡及其相關蛋白表達的影響/

注：miR-204-3p為微小RNA-204-3p，NG為正常對照組，HG為高糖刺激組，HG+miR-NC為高糖刺激后給予miR-204-3p陰性對照（miR-NC）干預組，HG+miR-204-3p為高糖刺激后給予miR-NC干預組miR-204-3p干預，Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關X蛋白，cleaved-caspase-3為活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3。與NG組比較，aP＜0.05；與HG+miR-NC組比較，bP＜0.05

cleavedcaspase-3蛋白0.24±0.03 0.59±0.05a 0.61±0.06 0.35±0.03b 150.797＜0.001組別NG HG HG+miR-NC HG+miR-204-3p t值P值重復次數3 3 3 3細胞凋亡率/%5.26±0.64 22.46±2.08a 24.58±2.47 11.25±1.65b 224.087＜0.001 Bcl-2蛋白0.68±0.06 0.28±0.03a 0.26±0.03 0.59±0.05b 208.823＜0.001 Bax蛋白0.31±0.03 0.73±0.07a 0.76±0.07 0.42±0.04b 147.220＜0.001

2.4抑制KLF6表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞損傷的影響相較于NG組，HG組小鼠腎臟足細胞MPC5中KLF6蛋白、desmin蛋白、Bax蛋白表達量及細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），synaptopodin蛋白及Bcl-2蛋白表達量顯著減少（P＜0.05）。HG+si-KLF6組小鼠腎臟足細胞MPC5中KLF6蛋白水平較HG+si-NC組顯著降低（P＜0.05），表明轉染成功。相較于HG+si-NC組，HG+si-KLF6組抑制KLF6表達明顯提升synaptopodin蛋白及Bcl-2蛋白水平（P＜0.05），而降低desmin蛋白、Bax蛋白水平及細胞凋亡率（P＜0.05）。見圖4、表4。

圖4 蛋白質印跡法檢測抑制KLF6表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞損傷的影響

2.5 miR-204-3p靶向調控KLF6表達通過TargetScan網站預測miR-204-3p與KLF6的3’UTR部分堿基可形成互補配對，推測miR-204-3p對KLF6表達存在一定調控作用。雙熒光素酶報告基因檢測發現共轉染miR-204-3p抑制WT-KLF6 3’UTR報告基因的熒光素酶相對活性（P＜0.05），對MUT-KLF6 3’UTR報告基因的熒光素酶相對活性無明顯作用（P＞0.05）。蛋白質印跡法結果顯示轉染miR-204-3p組較miR-NC組顯著抑制KLF6蛋白表達［（0.21±0.03）比（0.46±0.04），P＜0.05］，轉染anti-miR-204-3p組較anti-miR-NC組明顯提升KLF6蛋白水平［（0.87±0.08）比（0.43± 0.04），P＜0.05］（F＝259.743，P＜0.001）。見圖5、表5。

表4 抑制KLF6表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞損傷的影響/

表4 抑制KLF6表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞損傷的影響/

注：KLF6為鋅指蛋白Krüppel樣因子6，NG為正常對照組，HG為高糖刺激組，HG+si-NC為高糖刺激后給予si-NC干預組，HG+si-KLF6為高糖刺激后給予si-KLF6干預組干預，synaptopodin為肌動蛋白微絲偶聯蛋白，desmin為結蛋白，Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關X蛋白。與NG組比較，aP＜0.05；與HG+si-NC組比較，bP＜0.05

組別NG HG HG+si-NC HG+si-KLF6 F值P值細胞凋亡率/%7.02±0.71 23.46±2.15a 25.47±2.68 14.69±1.87b 164.495＜0.001重復次數3 3 3 3 KLF6蛋白0.43±0.04 0.86±0.08a 0.88±0.07 0.54±0.05b 120.370＜0.001 synaptopodin蛋白0.75±0.07 0.31±0.03a 0.28±0.03 0.62±0.06b 187.573＜0.001 desmin蛋白0.33±0.03 0.83±0.07a 0.86±0.08 0.49±0.05b 165.286＜0.001 Bcl-2蛋白0.69±0.06 0.29±0.03a 0.27±0.02 0.53±0.05b 197.676＜0.001 Bax蛋白0.32±0.03 0.75±0.07a 0.74±0.06 0.49±0.04b 141.927＜0.001

注：WT-KFL6為野生型KLF6，3’UTR為3’非翻譯區，miR-204-3p為微小RNA-204-3p，MUT-KLF6為突變型KLF6，KLF6為鋅指蛋白Krüppel樣因子6，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，a為miR-204-3p陰性對照，b為miR-204-3p，c為抗miR-204-3p陰性對照，d為抗miR-204-3p

表5 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-204-3p靶向調控KLF6的表達/

表5 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-204-3p靶向調控KLF6的表達/

注：miR-204-3p為微小RNA-204-3p，KLF6為鋅指蛋白Krüppel樣因子6，miR-NC為miR-204-3p陰性對照，WT-KFL6為野生型KLF6，MUT-KLF6為突變型KLF6

MUT-KLF6 1.02±0.08 1.00±0.09 0.498 0.625組別miR-NC miR-204-3p t值P值重復次數3 3 WT-KFL6 1.03±0.09 0.41±0.04 18.885＜0.001

2.6 KLF6過表達逆轉了miR-204-3p過表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞損傷的作用HG+miR-204-3p組比HG+miR-NC組顯著降低MPC5細胞中KLF6蛋白水平（P＜0.05），明顯影響synaptopodin蛋白、desmin蛋白、Bax蛋白、Bcl-2蛋白水平及細胞凋亡率（P＜0.05），結果同“2.2”和“2.3”。與HG+miR-204-3p+pcDNA組比較，HG+miR-204-3p+pcDNA-KLF6組顯著增加高糖刺激小鼠腎臟足MPC5細胞中KLF6蛋白表達量（P＜0.05），顯著減少synaptopodin蛋白和Bcl-2蛋白表達量（P＜0.05），升高desmin蛋白、Bax蛋白表達量和細胞凋亡率（P＜0.05）。見圖6、表6。

圖6 蛋白質印跡法檢測KLF6過表達逆轉了miR-204-3p過表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞損傷的作用

3 討論

miRNAs長度約為22個核苷酸，通過與下游靶mRNA的3’UTR發生特異性結合，調控基因表達，導致mRNA翻譯受到抑制或直接降解miRNA［10］。miRNAs異常表達與許多疾病的發生發展有關，包括糖尿病腎病［11-13］，如miR-770-5p通過靶向TP53調控足細胞增殖與凋亡，參與糖尿病腎病的發生發展［14］。Jo等［15］研究發現，miR-204直接靶向胰高血糖素樣肽1受體（GLP1R）3’UTR，miR-204的缺失促進胰島GLP1R表達，增強其對GLP1R激動劑的反應，從而改善葡萄糖耐受性，cAMP產生和胰島素分泌，以及對糖尿病的預防作用。synaptopodin是一種與肌動蛋白微絲偶聯的蛋白，可作為足細胞分化成熟的標志性分子，desmin是足細胞骨架中間絲蛋白，也是足細胞損傷的標志之一。在高糖刺激條件下，足細胞中synaptopodin蛋白水平降低，desmin水平提高，二者的異常表達與糖尿病腎病足細胞損傷密切相關［16］。本研究中，miR-204-3p在高糖刺激的MPC5細胞中顯著下調（P＜0.05），miR-204-3p過表達提升高糖刺激MPC5細胞中synaptopodin、Bcl-2蛋白水平，降低細胞凋亡率、desmin、Bax蛋白與cleaved-caspase-3蛋白水平。說明miR-204-3p可以保護高糖誘導小鼠足細胞損傷，并抑制細胞凋亡，與Han等［8］研究結果一致。

表6 KLF6過表達逆轉了miR-204-3p過表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞損傷的作用/

表6 KLF6過表達逆轉了miR-204-3p過表達對高糖刺激小鼠腎臟足細胞損傷的作用/

注：KLF6為鋅指蛋白Krüppel樣因子6，miR-204-3p為微小RNA-204-3p，HG+miR-NC為高糖刺激后給予miR-204-3p陰性對照（miR-NC）干預組，HG+miR-204-3p為高糖刺激后給予miR-204-3p干預組干預，HG+miR-204-3p+pcDNA為高糖刺激后給予miR-204-3p+pcDNA干預組，HG+miR-204-3p+pcDNA-KLF6為高糖刺激后給予miR-204-3p+pcDNA-KLF6干預組，synaptopodin為肌動蛋白微絲偶聯蛋白，desmin為結蛋白，Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關X蛋白。與HG+miR-NC組比較，aP＜0.05；與HG+miR-204-3p+pcDNA組比較，bP＜0.05

凋亡率/%23.65±2.47 12.41±1.36a 11.05±1.02 18.41±1.67b 103.034＜0.001組別HG+miR-NC HG+miR-204-3p HG+miR-204-3p+pcDNA HG+miR-204-3p+pcDNA-KLF6 F值P值重復次數3 3 3 3 KLF6蛋白0.83±0.08 0.39±0.03a 0.37±0.04 0.71±0.07b 138.696＜0.001 synaptopodin蛋白0.29±0.03 0.68±0.06a 0.69±0.07 0.38±0.03b 147.495＜0.001 desmin蛋白0.82±0.08 0.38±0.03a 0.36±0.04 0.68±0.06b 148.224＜0.001 Bcl-2蛋白0.24±0.03 0.57±0.05a 0.58±0.06 0.35±0.03b 128.354＜0.001 Bax蛋白0.77±0.06 0.34±0.03a 0.32±0.03 0.63±0.06b 195.867＜0.001

Krüppel樣因子（Krüppel-like factors，KLFs）是一種高度保守的鋅指蛋白，能結合特定的DNA基序并調節多種細胞功能，如細胞增殖、凋亡、分化和代謝［17］。KLF6是KLFs家族成員之一，在前列腺癌、肝細胞癌、膠質母細胞瘤、透明細胞腎細胞癌中等癌癥中表達異常［18-19］，在腎臟疾病等的發生發展中發揮著重要作用［20-23］。資料顯示，KLF6糖尿病大鼠模型近端腎小管上皮細胞中KLF6高表達［24］。高濃度葡萄糖可誘導人晶體上皮細胞中KLF6基因表達上調［25］。在糖尿病性肺纖維化大鼠模型中，KLF6蛋白和mRNA水平升高，高糖誘導KLF6表達量增加［26］。本實驗中，高糖刺激明顯促進MPC5細胞KLF6 mRNA和蛋白表達。抑制KLF6表達顯著上調高糖誘導MPC5細胞synaptopodin及Bcl-2蛋白水平，降低細胞凋亡率及desmin、Bax蛋白表達。提示KLF6是高糖刺激足細胞損傷過程中關鍵的影響因子。

為了進一步觀察miR-204-3p是否通過靶向KLF6來保護高糖誘導的小鼠足細胞損傷，采用生物學信息預測結合雙熒光素酶報告基因進行分析與驗證，結果證實KLF6是miR-204-3p的靶基因。上調或下調miR-204-3p表達明顯調控KLF6水平，表明miR-204-3p對KLF6表達呈負調控作用。此外，KLF6過表達逆轉miR-204-3p過表達對synaptopodin及Bcl-2蛋白表達的促進作用，及逆轉miR-204-3p過表達對desmin、Bax蛋白表達和細胞凋亡的抑制作用。說明miR-204-3p直接靶向KLF6保護高糖刺激的小鼠足細胞損傷，并抑制細胞凋亡。

綜上所述，miR-204-3p通過靶向調控KLF6，從而保護高糖誘導的小鼠足細胞損傷，并抑制細胞凋亡，為糖尿病腎病的診治提供潛在靶點。

（本文圖3見插圖12-4）