鋅摻雜二氧化硅在雪菊中木犀草苷分析中的應用*

韓 想， 阿迪拉·阿布都熱西提， 賀小剛，馮昱龍， 楚剛輝

(新疆藥食用植物資源化學重點實驗室 喀什大學 化學與環境科學學院，新疆 喀什 844000)

0 引 言

植物材料中的生物活性成分是新藥、功能性食品和食品添加劑的重要來源，這些活性成分主要是通過溶劑萃取從植物中得到的，這些活性成分具有多種結構的化合物組成，如萜類，醌類，黃酮類和生物堿類化合物。在各種生物活性成分分離方法中吸附分離法因為其具有高效，經濟的特點，在研究領域中得到了普遍認可和應用[1-2]。木犀草苷是雪菊中的黃酮類活性成分之一，對雪菊的分析主要體現在對黃酮類物質的提取及含量檢測方法研究，對分離提純等方面的研究相對較少[3-8]。木犀草苷是一種黃酮糖苷類化合物，即由木 犀草素結合一個單糖獲得的產物，研究表明，木犀草苷具有一系列藥理活性，如降低膽固醇含量，呼吸道殺菌作用以及抗腫瘤，抗感染，抗炎等作用，目前植物樣品中木犀草苷測定的方法較多的是色譜法及色譜聯用法，但這些方法卻在不同程度上存在著儀器成本較高，操作起來繁瑣，有機溶劑消耗量大等缺陷[9-14]。

由于檢測快速、易實現在線監測、對樣品無損害等特點，近紅外光譜分析被許多行業如煙草生產、農業應用和制藥分析等領域中大量使用[15-17]。為了進一步改善近紅外光譜分析方法的靈敏度，前人在將吸附預富集技術與近紅外光譜技術相結合測定微量成分的研究中取得了許多研究成果[18-20]。研究發現，木犀草素在一定條件下可以和某些金屬離子發生配位作用[21-23]，木犀草苷作為木犀草素的衍生物，基于這些研究，也可以考慮通過配位作用實現木犀草苷的分離富集。本研究通過制備的鋅摻雜二氧化硅作為吸附劑對雪菊所含的微量木犀草苷進行富集，采用近紅外漫反射結合化學計量學實現其中木犀草苷的靈敏、選擇性檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器和材料

AntarisⅡ近紅外光譜儀(美國Thermo 公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HY-2 型多用調速振蕩器(蘇省金壇醫療儀器廠)；TU-1900 型雙光束紫外可見分光光度計( 北京普析通用儀器有限公司)；SF-TDL-2SOA低速離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；IR-200型紅外光譜儀(美國Thermo公司)；WS70-1紅外快速干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)。

木犀草苷(上海晶純生化科技股份有限公司，98%)；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，98%)；無水乙醇、正硅酸乙酯、氫氧化鈉、甲醇、乙酸鋅等均為分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 鋅摻雜二氧化硅吸附材料的制備

稱量4.39 g乙酸鋅固體，加入甲醇試劑充分溶解，轉移到100 mL容量瓶中，定容，靜置備用。在250 mL的三頸燒瓶加入50 mL無水乙醇、2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、10 mL正硅酸乙酯和50 mL 0.2 mol·L-1的乙酸鋅甲醇溶液，35 ℃水浴下攪拌1 h，之后添加10 mL 1% 氫氧化鈉溶液充分攪拌12 h；可能的合成機理見圖1。

最后利用低速離心機離心分離，收集最終產物，蒸餾水洗調節pH至7左右，最后無水乙醇再洗滌一次，離心，并將產物于60 ℃烘干待用。

圖1 鋅摻雜二氧化硅吸附劑合成機理Fig 1 Synthesis mechanism of zinc-doped silica adsorbent

1.2.2 木犀草苷的吸附試驗

把木犀草苷作為分析測試對象，稱量0.25 g吸附劑(鋅摻雜二氧化硅材料)于100 mL的錐形瓶中，加入50.00 mL 配制好的木犀草苷樣品溶液，在常溫下于振蕩器中振蕩20 min，使用量筒式過濾器，收集濾渣進行近紅外光譜分析；在349 nm處測量濾液的吸光度，計算木犀草苷的吸附率，公式如下：

上式中，B0和B表示木犀草苷溶液吸附前和吸附后的吸光值。

1.2.3 木犀草苷樣品的制備與富集

木犀草苷樣品存在于雪菊提取液中，雪菊提取液的制備如下：量取適量雪菊，浸泡在含50 mL 35%的甲醇水溶液的100 mL錐形瓶中，放置過夜，將雪菊樣品超聲30 min，并過濾，收集備用，將上述溶液制備成不同濃度的69個雪菊提取液，濃度范圍為0.05～15.0 mg·L-1。稱量0.25 g鋅摻雜二氧化硅吸附劑于100 mL錐形瓶中，將上述制備的69個雪菊提取液分別倒入放置了吸附劑的錐形瓶中，并將這69個錐形瓶分別于常溫下振蕩20 min，抽濾，濾渣晾干(室溫)，使用近紅外光譜直接檢測富集了木犀草苷的鋅摻雜二氧化硅吸附劑。將得到的69個固體樣本近紅外光譜，其中有47個定量校正模型，22 個預測樣本(9對重復樣本)，建立了近紅外光譜分析方法。

1.2.4 光譜測量方法

在波數為4 000～10 000 cm-1之間進行掃描，4 cm-1的儀器分辨率，經積分球漫反射模式采集所有樣品的近紅外光譜，光譜儀于室溫下預熱1 h后開始進行測量，每隔1 h對其進行校正。每個樣品光譜及背景光譜均要經過64次掃描，并進行3次重復裝樣后測量，以提高儀器的信噪比，降低誤差。3次測量的光譜數據取平均值，以考慮樣品內部的變異性以及堆積密度和粒徑的差異。圖2為69個樣品的近紅外光譜，為了揭示近紅外光譜數據中存在的信息，必須通過一個校準的過程來建立預測模型。校準階段使用的樣本數據集必須代表當前和未來的預測樣本。這意味著在校準和驗證樣本數據集中必須考慮所有預期的變異源。在這里我們使用了偏最小二乘回歸(PLSR)來構建校正模型。并使用TQ analyst 9儀器軟件包選擇了4 188.6～9 009.8 cm-1的波長范圍。

圖2 69個雪菊樣本的近紅外光譜Fig 2 Near-infrared diffuse reflectance spectra of the 69 luteoloside samples

2 結果與討論

2.1 鋅摻雜二氧化硅吸附劑的紅外光譜

分別將二氧化硅與鋅摻雜二氧化硅吸附劑和KBr按1:100～200壓片，掃描300～4 000 cm-1范圍內紅外光譜，結果見圖3。通過與二氧化硅吸附劑的紅外光譜(a曲線)相比較，鋅摻雜二氧化硅吸附劑的紅外光譜(b曲線)在3 400～3 200 cm-1范圍內出現了氨基伸縮振動峰，在3 000～2 700 cm-1出現了飽和C-H伸縮振動峰，在1 600 cm-1左右處出現了碳碳雙鍵伸縮振動峰，在1 375 cm-1左右出現了甲基的C-H對稱彎曲振動峰，在720 cm-1左右出現了—(CH2)n—的面內搖擺振動峰。與二氧化硅的紅外光譜相比，鋅摻雜二氧化硅吸附劑中這些新峰的出現說明了金屬離子鋅已經結合到SiO2上。吸附木犀草苷后的鋅摻雜二氧化硅吸附劑的紅外光譜(c曲線)在3 400～3 200 cm-1范圍內出現了氨基伸縮振動峰，在1 650～1 560 cm-1范圍內出現氨基的彎曲振動峰，但這兩個峰明顯比b曲線吸收減弱，說明木犀草苷吸附到了鋅摻雜二氧化硅吸附材料上。

圖3 二氧化硅(a)，鋅摻雜二氧化硅吸附材料(b)和吸附木犀草苷后鋅摻雜二氧化硅吸附材料(c)的紅外光譜Fig 3 Infrared spectrogram of silicon and zinc-doped silica adsorption materials before and after adsorption of luteoloside

2.2 鋅摻雜二氧化硅對木犀草苷的吸附

為考察所制備的鋅摻雜二氧化硅吸附劑對木犀草苷的吸附情況，分別對木犀草苷水溶液和吸附抽濾后的濾液檢測紫外光譜，并將兩者的紫外光譜繪圖做對比，如下圖4。

由圖可知：在波長為349 nm下，木犀草苷出現了特征吸收，對比木犀草苷標準溶液(10 mg·L-1)的吸收曲線(a)，被鋅摻雜二氧化硅吸附材料吸附后的吸收曲線(b)顯示，在349 nm處的吸光度明顯減少。根據吸附材料上的官能團推測，它對木犀草苷的吸附機理可能是由于鋅與木犀草苷上的羥基絡合所致[24-26]，可能的機理見圖5，由圖5可以看出，鋅摻雜二氧化硅的吸附材料對木犀草苷的吸附效果比較好。

圖4 木犀草苷標準溶液吸附前(a)及吸附后(b)的紫外光譜Fig 4 UV spectra change for luteoloside before and after the adsorption

圖5 木犀草苷的吸附機理Fig 5 Adsorption mechanism of luteoloside

2.3 影響鋅摻雜吸附劑吸附木犀草苷過程的因素

2.3.1 質量對吸附能力的影響

準確配制10 mg·L-1木犀草苷的水溶液，用電子天平準確稱得0.15、0.20、0.25、0.30 g的吸附材料，分別加入100 mL錐形瓶中再向瓶中加入50.00 mL木犀草苷水溶液，充分振蕩20 min后進行抽濾并取其清液，于波長為349 nm下分別測定它們的吸光度，根據1.2.2的方法計算吸附率，并以吸附率對吸附材料用量(質量)作圖，其結果如下圖6(a)。由圖可以看出，木犀草苷的吸附率隨著吸附材料的質量增加而增加，當吸附材料的質量是0.25 g時吸附率為最大即87.1%，之后吸附率幾乎不再變化，故吸附材料的最恰當使用質量為0.25 g。

2.3.2 pH對吸附能力的影響

另外，對pH的影響進行討論，準確配制pH為2、4、6、7、8、10的濃度均為10 mg·L-1的木犀草苷溶液。稱量0.25 g的鋅摻雜二氧化硅吸附劑，按照1.2.2的方法振蕩吸附，于波長為349 nm下測定吸附后的吸光度，計算吸附率，并用吸附率對pH作圖，見下圖6(b)。由圖可知：木犀草苷的吸附率隨著pH值的增大而增大，在pH大于或等于7時，木犀草苷的吸附率基本不再發生變化，基本趨于穩定狀態，因此選擇pH為7的中性條件下進行吸附，且此時木犀草苷的吸附率為86.7%。

2.3.3 時間對吸附能力的影響

配制10 mg· L-1木犀草苷的水溶液，稱量0.25 g鋅摻雜二氧化硅吸附劑，在室溫下振蕩2、5、10、20、30、40、60 min，離心后取上層清液，在波長為349 nm下測定它們的吸光度并計算其吸附率，以吸附率對吸附時間作圖，見下圖6(c)。由圖可知，振蕩時間在20 min時木犀草苷的吸附率到達最大值，在此時間下吸附率達到了87.1%，因此20 min為最佳振蕩時間。

圖6 質量(a)、pH(b) 及時間(c)對吸附的影響Fig 6 Effects of quality, pH and time on the adsorption

2.4 用近紅外光譜定量分析木犀草苷的結果

2.4.1 建立木犀草苷定量校正模型

根據PLS建立了木犀草苷定量模型，為了完善定量校正模型，采用多元散射校正(MSC) 、一階導數(1st ) 、Savitzky-Golay(SG) 平滑、 小波變換(CWT) 、標準正態變換(SNV)對光譜的數據進行了預處理[27-28]。根據蒙特卡洛交叉驗證(MCCV) 法得到模型的因子數為6、7、8，不同的光譜預處理方法得到的木犀草苷PLS 定量校正模型的結果見表1 。這是由于近紅外光譜中既包含了木犀草苷的信息，也包含有鋅摻雜二氧化硅吸附劑中的成分、樣品基質等干擾。通過Matlab 程序實現以上各種光譜預處理和PLS定量模型的建立，表1中顯示的是各種光譜預處理后得到的木犀草苷定量模型的預測能力，每一種預處理方法所得的定量預測模型分別通過三個參數：預測殘差值(RPD)、交叉驗證均方根誤差(RMSECV)和相關系數R檢驗。木犀草苷的預測濃度與實際濃度之間的相關性是由R體現的，預測濃度與實際濃度的偏離程度則是由RMSECV來體現的。根據之前發表的文獻表明，光譜預處理方法得到的定量校正模型可以應用在定量預測的前提是RPD大于2.5，RPD 越大得到的定量結果越準確[29]。與無處理方法作比較，從表1 的結果可以看出，樣品的光譜經CWT、一階導數(1st ) 、二階導數(2nd ) 、SNV +CWT、SNV+1st 處理后，校正模型的R值減小、RMSECV 值增大、RPD 值減小，表明這些與處理方法可以有效改善定量結果； 而經過MSC、MSC+CWT、SNV、MSC+1st方法處理后，模型與無處理方法相比，R值增大，RMSECV 誤差減小，RPD 值增大，這四種光譜預處理方法結果表明背景干擾均得到一定消除，這些結果表明對木犀草苷的定量預測能力有所提高。為了讓預測的結果更準確，我們選擇了SNV 方法讓選擇誤差最小，RPD值最大來處理全部樣品的近紅外光譜。研究表明，樣品微粒分布不均勻及微粒體積不同產生的散射會使光譜中含有大量干擾信息，而SNV作為一種常用的光譜校正和增強技術，它可以校正樣品散射產生的光譜誤差，從而產生更好的校正和預測性能[30]。

表1 木犀草苷PLS 模型及交叉驗證的結果

2.4.2 木犀草苷定量模型的論證

為了檢驗定量校正模型的預測結果，我們用了22 個外部預測集樣品(9 對重復樣本)檢驗了所建立的偏最小二乘模型。預測集樣品使用了和校正集樣品一樣的光譜測量條件、制備方法、建模方法。圖7顯示了預測集樣品(實心圈)和校正集樣品(虛心圈)的關系圖，圖上的參考濃度體現了兩種樣品集中偏最小二乘模型中參考濃度與預測濃度兩者的擬合關系，以 HPLC測定的結果為準，圖7結果得到預測均方根誤差(RMSEP)為0.6498 mg·L-1，預測集相關系數為0.9909，木犀草苷預測集樣本回收率的范圍在87%～118%內，說明木犀草苷校正模型對預測集樣品有較好的預測結果，模型穩健有效。上述實驗結果說明，雖然存在吸附劑、樣品基質的干擾，但經過對近紅外光譜的標準正態變換(SNV) 法預處理，仍能夠采集樣品光譜中木犀草苷的定量信息，能夠較為準確地測定雪菊提取液中的木犀草苷。

圖7 木犀草苷參考濃度和預測濃度相關關系Fig 7 Relationship of predicted concentration and the reference values of luteoloside

3 結 論

(1)通過簡單溫和的方法實現了鋅摻雜二氧化硅吸附劑的制備，吸附實驗發現，該吸附劑對木犀草苷具有良好的吸附效果。在紅外光譜表征后，將它作為用于雪菊提取液中木犀草苷的富集與近紅外光譜檢測的吸附劑。

(2)把木犀草苷當作分析對象，考察了吸附劑時間、質量和pH 對吸附能力的影響，結果表明在吸附劑質量為0.25 g，中性條件下常溫振蕩吸附20 min 時，對木犀草苷的吸附率接近90%，表現出吸附劑對木犀草苷的檢測靈敏度有所提升。

(3)使用近紅外漫反射光譜結合化學計量學對雪菊中的木犀草苷進行定量分析。分析結果表明，用SNV 對近紅外光譜進行預處理效果最好，并且使用了PLSR方法建立木犀草苷的定量校正模型。其中用22個樣本(9 對重復樣本) 當作預測集對回歸模型的準確性實行了驗證。在較低濃度范圍0.05～15.0 mg·L-1內，預測集相關系數為0.9909，預測集樣本的回收率在87%～118%之間，實現了雪菊提取液中木犀草苷微量級的定量預測。