藥物性肝損傷發病機制研究進展

郭榮榮 張繚云

1.山西醫科大學 (山西 太原，030001) 2.山西醫科大學第一醫院

藥物性肝損傷(DILI)是一類復雜疾病，根據其病理特征分為肝細胞損傷型、膽汁淤積型、混合型和肝血管損傷型，臨床中最常見的是肝細胞損傷型[1]。DILI可分為固有型肝損害和特異質型肝損害，其中藥物固有型肝損害主要為劑量依賴性，由于藥物或其代謝物的直接毒性導致肝損傷，并且具有較短的潛伏期，在動物模型中是可重復的，具有可預測性，例如對乙酰氨基酚(APAP)過量。然而，絕大多數DILI是特異性的或不可預測的，并且在大多數情況下，常規動物模型藥理學及毒理學無法確定后續臨床毒性的風險[2]。DILI的發病機制是多種因素相互作用的結果，這些因素盤根錯節，已經成為近年來研究的熱門話題，但其損傷機制目前尚未完全闡明，本文就近幾年DILI的直接肝損傷機制、特異質性肝損傷機制、線粒體功能損傷、遺傳等方面進行綜述。

1 藥物的直接肝損傷機制

藥物通過自由基或代謝介質使細胞膜脂質過氧化，損傷肝線粒體導致肝細胞損傷；也可通過改變細胞膜或細胞內分子結構，激活凋亡途徑等。Kaplowitz[3]對DILI的發病機制提出了特異性“上游”事件和非特異性“下游”事件的假說。“上游”事件：藥物或其代謝產物對肝臟的直接損傷；“下游”事件：肝細胞內不同損傷與保護通路之間的失衡。Russmann等[4]將DILI的過程概括為三個步驟：藥物或其代謝產物直接損傷引起肝細胞應激反應，導致自身免疫反應；線粒體膜通透性改變；線粒體膜通透性改變使三磷酸腺苷合成減少，最終導致肝臟細胞的壞死或凋亡。

肝臟中藥物的代謝可分為兩相。第Ⅰ相代謝主要是親脂性藥物通過細胞色素P450酶(CYP)氧化、還原和水解等反應形成一系列極性基團；第Ⅱ相代謝也是主要通過CYP450代謝產生親水性且更容易被清除的代謝產物。藥物誘導肝損傷的發病機制通常涉及有毒藥物或其代謝物的參與，多與劑量相關，具有潛伏期短的特點。然而，在使用呋喃妥因、磺胺類藥物(例如紅霉素和阿莫西林-克拉維酸鹽)等藥物或甚至停藥后藥物經過非常長的潛伏期后才出現免疫反應時，會出現例外情況。在發生DILI的藥物中，對APAP的劑量依賴性和其自身的肝毒性是DILI發生的最常見原因，是可預測的。APAP主要由肝臟代謝，其主要代謝產物是葡萄糖醛酸苷或硫酸鹽結合物，經轉運體轉運出肝臟，由膽汁或腎臟排泄。而少量APAP通過CYP450酶(主要是CYP2E1)在肝臟中轉化為毒性親電子芳基化代謝物N-乙酰基-對苯醌亞胺(NAPQI)，該毒性代謝產物經谷胱甘肽S轉移酶(GST)解毒。長期過量的APAP使葡萄糖醛酸化和硫酸化途徑飽和，過多的NAPQI會耗盡GST滿足其代謝，并且與蛋白巰基共價結合形成蛋白加合物，造成氧化應激和線粒體功能障礙，引起急性肝小葉中心壞死[5]。參與APAP代謝的代謝酶中，CYP3A4也必不可少，有研究表明，增加CYP3A4酶的活性可能使APAP的毒性作用更加顯著。相反，當CYP3A4酶的活性受到抑制時，因APAP過量引起的肝毒性可顯著降低。這種可預測的APAP毒性過程使得N-乙酰半胱氨酸仍然是今天APAP過量首選的治療藥物。

2 藥物的特異質性肝損傷機制

盡管在臨床藥物開發之前，在體外測試系統和各種動物模型中進行了廣泛的安全性測試，但是該測試經常無法識別潛在的肝毒性藥物。廣義上，藥物的特異質性肝損傷機制可分為兩類：超敏反應型(也稱免疫特異質性肝損傷)和代謝特異質性肝損傷。

2.1 免疫特異質性肝損傷 免疫特異質性肝損傷患者可出現發熱、嗜酸粒細胞增多、皮疹、自身抗體陽性和史蒂文斯-約翰遜綜合征。非免疫反應較少出現上述特征，并且免疫介導的DILI具有較長的潛伏期。

2.1.1 肝臟的固有免疫 常見的固有免疫細胞包括單核巨噬細胞、樹突細胞和自然殺傷T(NKT)細胞等，當發生DILI時，受損傷的肝細胞周圍可見大量的巨噬細胞浸潤，同時可以觀察到骨髓中前體巨噬細胞增殖[6]。高遷移率族蛋白B1是一種細胞損傷相關模式，當肝臟細胞發生凋亡或壞死時可以被釋放，細胞損傷相關模式還可誘導中性粒細胞浸潤。肝臟含有豐富的淋巴細胞，從肝臟分離的自然殺傷(NK)細胞可能對各種細胞誘導細胞毒性，而NKT細胞一般要求在白細胞介素(IL)-2的存在才能發揮效應。有研究表明，發生DILI時，NK細胞可促進中性粒細胞的募集，同時NK細胞也可以分泌IL-17，IL-17有不同的免疫調節作用[7]。然而，其他研究表明，由α-半乳糖神經酰胺誘導的肝細胞損傷，NKT細胞被特異性激活，并產生大量IL-17，其抑制了炎癥的發展[8]。這兩種不同的觀點，需要我們進一步研究NK/NKT在肝臟先天免疫中的作用。

2.1.2 肝臟的適應性免疫 適應性免疫反應可能是DILI發生的最后共同事件。由于藥物或藥物的活性代謝產物與肝細胞內共價蛋白結合，形成藥物-蛋白質加合物，被識別為抗原而激活外周血淋巴細胞，引起抗體形成或T細胞介導的細胞裂解，誘導免疫介導的反應或直接肝毒性，而發生超敏反應，占所有特異質性DILI病例的23%～37%。此外，由于血液循環使得肝細胞對藥物的攝入增加，形成更多的活性代謝物，從而增加了發生DILI的風險。目前已經提出了一些不同的假設來解釋DILI適應性免疫激活模式，如半抗原理論假說、 P-i 理論假說和改變肽庫譜假說。

半抗原理論假說：藥物的代謝產物在肝細胞中經過共價結合形成藥物-蛋白質復合物，這些復合物被抗原呈遞細胞呈遞給人類白細胞抗原(HLA)Ⅱ分子，然后與CD4+T細胞受體相互作用，激活下游的細胞毒性CD8+T細胞和B細胞[9]。然后由細胞質細胞產生大量針對抗原的特異性抗體。如麻醉吸入劑氟烷，一些抗驚厥藥如苯妥英，以及某些抗生素如甲氧芐啶、磺胺甲噁唑、頭孢唑啉和環丙沙星[10]。這些藥物與肝臟蛋白質如細胞色素P450酶共價結合，作為半抗原-抗原加合物呈遞給MHCⅡ類分子，從而引發激活CD8+T細胞的免疫應答。T細胞反過來表達Fas配體和腫瘤壞死因子，它通過在肝細胞表面大量表達的死亡受體介導肝細胞死亡[11]。導致免疫激活的易感HLA多態性本身并不能完全解釋肝毒性，因為大多數鑒定的與毒性相關的HLA單倍型在一般人群中非常常見，而特異質性DILI 是罕見的事件。因此，并非所有具有易感HLA基因多態性的個體在暴露于藥物時都表現出特異質性DILI，這可能與肝臟固有的免疫狀態和調節免疫耐受有關[10]。

P-i假說即藥理學相互作用：一些藥物可以直接與主要組織相容性復合物分子相互結合，以激活免疫系統。如利多卡因、塞來昔布、卡馬西平、希美加曲，不需要共價結合蛋白質形成新抗原就能刺激并致敏T淋巴細胞。相關研究已證實，希美加曲直接抑制肽可與HLA DRB1*0701結合，支持藥物與該HLA結合位點的直接相互作用[12]。

改變肽庫譜假說：某些藥物可能使內源性肽錯配到HLA，導致自身免疫。阿巴卡韋皮疹和史蒂文斯-約翰遜綜合征[13]可解釋這一假說。阿巴卡韋與HLA-B*57:01非共價結合，改變抗原裂縫的形狀和化學結構，隨后呈遞給T細胞，驅動CD8+T細胞活化，最后表現出超敏反應綜合征。

部分DILI還有其他假設，如多重決定因素相互作用假說，該假說指出多種危險因素(如多態性、年齡、性別、既往病癥)可能重疊在一起誘導DILI[14]。

2.2 代謝特異質性肝損傷 代謝特異質性肝損傷與藥物代謝酶相關性更大，其中CYP450酶是主要的藥物代謝酶。藥物代謝酶的遺傳多態性，常使CYP450酶系統代謝能力低下，藥物或其中間代謝產物積累而導致DILI發生，特征為具有較長潛伏期，無過敏癥狀。研究發現，異煙肼可顯著提高CYP2E1酶的敏感性，導致肝損傷的危險提高3～4倍。后來又發現參與藥物代謝的Ⅱ相代謝酶GST也存在遺傳多態性，GST可結合氧化修飾產物，降低細胞毒性。研究報道，GSTM1和GSTT1基因缺失可導致藥物代謝酶活性降低甚至不發揮其本身的作用。在GSTM1和GSTT1基因缺失的患者中，DILI的發生率增加[15]。而有研究卻顯示GSTM1和GSTT1缺失基因型與肝毒性均無顯著相關性[16]，因此可見，GST基因型在抗結核藥物所致DILI中的作用仍有待進一步研究。

3 線粒體功能損傷

由藥物所致的線粒體功能損傷常常是多種機制作用的結果。線粒體為細胞生命提供直接能量并維持肝細胞中的環境平衡,也是氧化應激損傷的重要目標細胞器。活性代謝產物的廣泛生產是肝損傷的關鍵步驟[17],如CYP 450酶代謝產生的新電子基和自由基，會影響酶的活性并且能攻擊、破壞細胞膜和細胞器膜及膜受體，從而使肝細胞受損。APAP攝入體內后，APAP中間代謝產物NAPQI和線粒體衍生的活性氧損傷線粒體DNA,并激活c-Jun N末端激酶信號通路，線粒體衍生的活性氧擴增導致線粒體膜通透性增加，使體內超氧化物水平增高，鈣穩態改變，減少ATP的合成，增加NF-κB p65的活化和促炎因子腫瘤壞死因子-α基因的表達，最終導致肝細胞壞死[18]。異煙肼誘導的DILI中，異煙肼在CYP2E1的催化下生成毒性代謝產物乙酰肼和肼從而損傷肝細胞，乙酰肼與肝細胞內的生物大分子共價結合，繼續水解可成為具有肝毒性的肼，導致肝內的GSH耗竭而引起線粒體膜通透性改變，損傷肝細胞[19]。也有可能產生共價藥物-蛋白質加合物，形成半抗原而激活免疫應答。當然也可以由于異煙肼或其代謝物直接引起線粒體損傷，這均會導致線粒體發生氧化應激反應和能量穩態失去平衡[14]。若當前線粒體已經存在這種缺陷，即使是異煙肼尚未到達刺激機體肝細胞破壞的濃度，也可能由于復合物功能的潛在損害，而導致顯著的肝細胞損傷。相關研究已經表明，線粒體損傷的其他機制還包括：在線粒體進行的β-氧化受損，線粒體呼吸鏈受損，線粒體膜破壞和線粒體DNA損傷，分別由他莫昔芬、丙戊酸、雙氯芬酸和他克林引起[20]。另外，由于藥物或其代謝產物與膽管細胞中的轉運蛋白結合，影響膽管細胞內膽汁酸的正常分泌，導致膽汁排出受阻，膽汁淤積，大量的膽汁酸鹽造成肝細胞、膽管細胞的間接損傷[21]。

因此，藥物的直接肝毒性對線粒體的損傷涉及結構變化和功能紊亂等多種機制。任何一種藥物對線粒體的損傷都是多途徑相互作用，包括線粒體DNA的復制和表達受到抑制、內膜通透性增加、電子傳遞體系的抑制和新陳代謝的抑制等，是一個復雜的過程。

4 遺傳因素

以前的遺傳關聯研究主要集中在參與藥物攝取、代謝、轉運或解毒的候選基因中，可用于預測藥物藥代動力學和藥效學參數。例如，N-乙酰基轉移酶2基因活性降低和CYP2E1介導的氧化代謝活性增加與異煙肼肝毒性有關。然而，這些關聯常常在獨立隊列研究中不能復制。識別遺傳關聯的另一種方法是在沒有特定預先假設的情況下收集DILI病例和群體對照中的整個人類基因組。在DILI中首次成功進行的GWA研究發現，氟氯西林誘導的肝損傷與6號染色體上的HLA-B*5701等位基因之間存在非常強的關聯，氟氯西林相關的膽汁淤積性肝炎患者中，HLA-B* 5701攜帶率比普通人群高3倍,而HLA-B* 5701可使患者發生氟氯西林肝損傷的風險至少增加80倍[22]。氟氯西林在歐洲國家被廣泛使用，在開始治療的45 d內僅有小于1%的患者發生膽汁淤積型肝損傷，但是導致肝損傷易感性增加的確切機制還需進一步探索。研究表明，HLA-DRB1*1501-DQB1* 0602與阿莫西林-克拉維酸和氟烷等藥物引起的藥物性膽汁淤積強相關[23]，而HLA-A * 3002 和B*1801則與阿莫西林-克拉維酸引起的肝細胞損傷型DILI密切相關[24]。此外，由于HLA多態性在種族上受到限制，在一個患者群體中缺乏DILI易感性的遺傳關聯并不排除另一組中的正相關，如HLA易感性等位基因在漢族和歐洲人對卡馬西平過敏反應不同。在未來5～10年中，將使用基因測序完成對特異質性DILI易感性的宿主遺傳多態性的研究。

越來越多的證據顯示，DILI的發病機制復雜，是上述要素互相作用的結果，而且各機制之間互為因果。如細胞應激和線粒體損傷可用作觸發免疫反應的危險因素，先天性免疫參與啟動適應性免疫應答，各種損傷機制互相關聯，最終都導致線粒體損傷。目前了解到的DILI發病機制只是九牛一毛，預防和治療DILI還需要深入了解肝毒性機制。我們需要從免疫學和分子生物學角度更深入地研究DILI發病靶點。相信在不久的將來，能降低DILI的發病水平，可以找到預防、診斷和治療DILI的方法。