天麻素對癲癇大鼠海馬區病理結構的影響及對mTOR、caspase-9的調節作用

楊照康，吳啟云，袁易輝，蔡苗珍，薛紅，張林，李若照，翁檸*

(1.貴州中醫藥大學第二臨床醫學院，貴州 貴陽；2.貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽)

0 引言

癲癇的發生與大腦神經元突發性異常放電所致的大腦功能障礙相關，表現為發作性運動、自主神經、感覺、意識、精神障礙[1]。目前治療癲癇的方法較多，雖可改善癲癇癥狀，但效果不佳，天麻素是在天麻中所提取的一種有效成分，具有較強的鎮痛、鎮靜、抗驚厥、抗癲癇的作用，經作用于中樞神經系統，發揮神經細胞保護作用[2]。基于此，在本文研究中構建戊四氮致癇大鼠模型，分析天麻素對致癇模型大鼠mTOR、caspase-9的調節作用及對大鼠行為學、海馬區病理結構的影響，為臨床上癲癇的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

研究動物：選取120只Wistar雄性大鼠，體重為180-240g，所有大鼠均購自三峽大學動物實驗中心，合格證號：SCXK(鄂)2017-0012，單籠飼養，自由飲水、進食，在相對濕度30%-35%、溫度為(23.8±1.5)℃的環境中喂養1周，光照12h/d。本研究獲我院倫理委員會批準。

主要試劑：戊四氮、天麻素(美國Sigma公司)；ATG7、mTOR、caspase-9 PCR試劑盒(武漢微克賽思科技有限公司 )。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模

將120只大鼠隨機分為正常組(A組)、模型組(B組)、天麻素小劑量組(C組)、天麻素中劑量組(D組)、天麻素大劑量組(E組)、丙戊酸鈉組(F組)各20只。B組、C組、D組、E組、F組使用戊四氮造模，均腹腔注射戊四氮(PTZ)亞驚厥劑量32mg/kg·d，使用前1h用生理鹽水配制成溶液，濃度為2.5mg/l，每日清晨注射一次，連續注射28d。每次給藥后觀察30min；停藥7d后，用同樣的方法點燃，1次/d，連續5d。凡連續4次出現2級以上發作或者連續出現2次5級發作即判定該鼠被慢性點燃。

1.2.2 給藥

各組繼續每日予維持量PTZ(20mg/kg.d)腹腔注射，使其保持癲癇狀態，B組在腹腔注射PTZ前2h腹腔注射生理鹽水。C組、D組、E組在維持量腹腔注射PTZ前2h腹腔注射天麻素，天麻素劑量按大鼠平均體重200g/只計算，分別予小劑量 (30mg/kg)、中劑量 (60mg/kg)、大劑量 (120mg/kg)天麻素；F組在維持量腹腔注射PTZ前2h腹腔注射丙戊酸鈉(VPA)，按成人劑量(20mg/kg·d)等效換算成大鼠劑量為120mg/kg·d。

1.2.3 行為學觀察

記錄各組大鼠驚厥發生率(TSR)、癇性發作潛伏期(ESL)、強直性驚厥潛伏期(TCL)情況。

1.2.4 樣本采集

使用10%的水合氯醛注射于大鼠腹腔做麻醉處理后迅速取海馬組織，分為均勻2等份，其中1份做海馬神經細胞分離，另外1份在液氮中保存用于后續檢測。

1.2.5 病理組織學觀察

取1份海馬組織切片行HE染色處理，于顯微鏡下觀察大鼠海馬組織病理變化。

1.2.6 ATG7、mTOR、caspase-9表達量檢測

將液氮中保存的海馬組織，加入1mL Trizol研磨為粉末狀，提取總RNA，檢測RNA純度、含量，使用Takara逆轉錄試劑盒行逆轉錄處理后獲得cDNA，使用Primer5.0軟件設計引物序列，RT-PCR法檢測ATG7、mTOR、caspase-9表達量，采用2-△△Ct計算。以GAPDH作為內參。ATG7引物序列：上 游：5’-GTGTACGATCCCTGTAACCTAACCC-3’，下游：5’-CGAAAGCAGAGAACTTCAACAGACT-3’。mTOR引物序列：上游：5’-CAGTTCGCCAGTGGACTGAAG-3’，下游：5’-GCTGGTCATAGAAGCGAGAC-3’。caspase-9 引 物序 列：上 游：5’-ATACACCCTGGACTCGGATCC-3’，下 游：5’-TGCTGAAGCTTCTCACAGTCC-3’。 內 參 基 因 GAPDH引物序列：上游：5’-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3’，下游：5’-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 六組大鼠行為學對比

如表1所示，C組、D組、E組、F組TSR低于B組，具有統計學差異(P＜0.05)；E組、F組TSR低于C組、D組，具有統計學差異(P＜0.05)；E組、F組TSR比較，無統計學差異(P＞0.05)。C組、D組、E組、F組ESL、TCL高于B組，具有統計學差異(P＜0.05)；E組、F組ESL、TCL高于C組、D組，具有統計學差異(P＜0.05)；E組、F組EST、TCL比較，無統計學差異(P＞0.05)。

表1 六組大鼠行為學對比(±s)

表1 六組大鼠行為學對比(±s)

注：與 B組相比，bP＜0.05；與 C組相比，cP＜0.05；與 D組相比，dP＜0.05。

組別 只數 TSR(n,%) ESL(min) TCL(min)A組 20 0 - -B 組 18 18(100.00) 10.12±0.98 20.86±1.09 C 組 18 13(72.22)b 13.20±1.03b 24.46±2.03b D 組 19 12(63.16)b 16.34±2.00bc 28.65±2.02bc E 組 19 5(26.32)bcd 25.34±3.46bcd 36.49±3.66bcd F 組 19 6(31.58)be 24.31±3.98bcd 35.12±2.13bcd

2.2 各組大鼠病理組織觀察

如圖1所示，正常組大鼠海馬結構、形態正常，細胞排列較為整齊，細胞核、核仁大小正常，著色均勻；模型組大鼠海馬結構改變，細胞核固縮、核仁變小，著色不一，神經元壞死數量較多；天麻素低、中劑量組細胞排列、皺縮、細胞核固縮程度與模型組相比減輕。天麻素高劑量組及丙戊酸鈉組大鼠海馬區神經元海馬結構有較輕的損傷現象，神經元存活數目增多。

圖1

2.3 六組大鼠海馬神經細胞自噬相關蛋白ATG7表達量比較

如表2所示，B組、C組、D組、E組、F組ATG7表達量高于A組，具有統計學差異(P＜0.05)；C組、D組、E組、F組ATG7表達量低于B組，具有統計學差異(P＜0.05)；E組、F組ATG7表達量低于C組、D組，具有統計學差異(P＜0.05)；E組、F組ATG7表達量比較，無統計學差異(P＞0.05)。

表2 六組大鼠海馬神經細胞自噬相關蛋白ATG7表達量比較(±s)

表2 六組大鼠海馬神經細胞自噬相關蛋白ATG7表達量比較(±s)

注：與A組相比，aP＜0.05；與 B組相比，bP＜0.05；與C組相比，cP＜0.05；與 D 組相比，dP＜0.05。

組別 只數 ATG7 A組 20 0.38±0.15 B組 18 1.98±0.69a C組 18 1.32±0.16ab D組 19 1.02±0.68abc E組 19 0.61±0.38abcd F組 19 0.62±0.31abcd

2.4 六組大鼠mTOR、caspase-9表達量比較

如表4所示，B組、C組、D組、E組、F組mTOR、caspase-9表達量高于A組，具有統計學差異(P＜0.05)；C組、D組、E組、F組mTOR、caspase-9表達量低于B組，具有統計學差異(P＜0.05)；E組、F組mTOR、caspase-9表達量低于C組、D組，具有統計學差異(P＜0.05)；E組、F組mTOR、caspase-9表達量比較，無統計學差異 (P＞0.05)。

表4 六組大鼠mTOR、caspase-9表達量比較(±s)

表4 六組大鼠mTOR、caspase-9表達量比較(±s)

注：與A組相比，aP＜0.05；與 B組相比，bP＜0.05；與C組相比，cP＜0.05；與 D 組相比，dP＜0.05。

組別 只數(n) mTOR caspase-9 A 組 20 0.34±0.05 0.22±0.06 B 組 18 1.72±0.68a 1.89±0.49a C 組 18 1.29±0.38ab 1.34±0.62ab D組 19 1.00±0.11abc 1.02±0.35abc E 組 19 0.61±0.12abcd 0.51±0.22abcd F 組 19 0.65±0.19abcd 0.53±0.23abcd

3 討論

癲癇較為復雜，表現為反復發作的特點，目前已成為一種慢性疑難頑癥，常規西醫治療效果不佳，因此尋找有效治療此病的藥物對修復癲癇患者受損神經元、促進疾病恢復具有重要的意義。

天麻素是從蘭科植物天麻中所提取的一種提取物，是天麻的重要有效成分，經調節大腦皮層興奮、抑制過程間平衡失調發揮其鎮痛、鎮靜、安眠的作用，發揮神經病理損傷保護、抑制神經細胞凋亡[3]。另外天麻素還可緩解腦血管痙攣、增加心腦血流量、清除機體過多對的自由基、改善體液免疫、細胞免疫[4]。研究發現[5]，天麻素可抑制戊四唑誘導的癲癇模型陣攣性驚厥癥狀。本文研究發現，天麻素可延長ESL、TCL，降低驚厥發生率，模型組大鼠海馬結構改變，細胞核固縮、核仁變小，著色不一，神經元壞死數量較多；天麻素低劑量和中劑量組細胞排列、皺縮、細胞核固縮程度與模型組相比減輕。天麻素高劑量組大鼠海馬區神經元結構有較輕的損傷現象，說明天麻素具有抗驚厥作用，可改善模型大鼠行為學及癲癇大鼠海馬區病理結構。

自噬是與細胞分化、存活、凋亡相關，與細胞凋亡相互拮抗、促進，在癲癇的發生發展中具有雙重的作用，低水平的自噬可保護神經元，高水平自噬可損傷神經元[6]。研究發現[7]，自噬調節屬于一種較為復雜的過程，其中包括PI3K、mTOR、Ca2+、自噬相關蛋白ATG7等均與自噬相關，在自噬過程中發揮不同的作用。mTOR屬于一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于胞內中心信號調節因子，與細胞增殖、凋亡、自噬、免疫抑制、蛋白質翻譯等等生物學功能相關，其主要作用為調節細胞生長、細胞自噬、細胞凋亡等[8]。本文結果顯示，天麻素可抑制癲癇大鼠海馬神經細胞自噬，其作用機制可能與抑制mTOR、自噬相關蛋白表達相關。

研究顯示[9]，隨著癲癇的不斷進展，海馬神經細胞凋亡愈發加劇，caspase家族屬于一組半膀氨酸蛋白酶，可經介導和執行死亡指令參與細胞凋亡凋亡，caspase-9屬于此家族成員之一，屬于啟動分子，可啟動線粒體通路，介導凋亡的發生。臨床研究發現[10]，戊四氮所致的癲癇可激活caspase-9，使其參與癲癇持續狀態的細胞凋亡中，與癲癇患者神經元損傷相關。本文結果顯示，天麻素可抑制癲癇大鼠海馬神經細胞凋亡，其作用機制可能與抑制caspase-9表達相關。

綜上所述，天麻素能改善戊四氮致癇模型大鼠行為學指標以及海馬區病理結構，其作用機制可能與調控mTOR、caspase-9等表達，調控凋亡及自噬相關，為抗癲癇治療提供研究思路。