芪柏愈瘍油對糖尿病大鼠潰瘍創面中IL-1β表達的影響

楊旭，王叢

(江蘇省南通市中醫院，江蘇 南通)

0 引言

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)具有較為復雜的發病機制，是周圍血管、神經病變及感染等因素綜合作用的結果，其治療是臨床急需解決的重要難題之一。芪柏愈瘍油外用治療糖尿病足潰瘍，應用此藥在臨床上對糖尿病足潰瘍患者進行治療，總有效率達到88.2%，臨床治療中發現芪柏愈瘍油可以減輕創面炎癥反應，改善肉芽組織形態，促進創面愈合。

近代研究發現炎癥反應的延遲以及失調與糖尿病足潰瘍創面延遲愈合密切相關[1]。正常的炎癥反應是在促炎信號的調節下，炎細胞有規律的募集，炎細胞發揮作用后能從創面及時有序的清除，從而終止炎癥反應，使修復過程順利過渡到增殖期。當炎癥反應異常時，會出現炎細胞消退延遲，使修復停滯在炎癥期，影響創面正常修復的進程，糖尿病足潰瘍創面就存在炎癥細胞過度浸潤、炎癥消退延遲的現象[2]。此次研究以芪柏愈瘍油為干預藥物，以糖尿病大鼠潰瘍模型為研究對象，采用免疫組化檢測方法，研究芪柏愈瘍油促進糖尿病大鼠潰瘍創面愈合的作用，進一步明確芪柏愈瘍油對潰瘍創面的作用機制，為糖尿病足潰瘍的中醫外治療法提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與實驗環境

SD雄性大鼠，8-10周齡，體重為150±20g，購自黑龍江中醫藥大學動物實驗中心。動物飼養及無菌手術均在動物實驗室進行，實驗動物飼養條件符合《實驗動物普通環境及設施(編號為GB14925-200 1)》，按照《黑龍江省實驗動物管理條例》對動物進行飼養管理及實驗操作。飼養溫度為21±2℃，相對濕度40-70%，室內明暗交替各12小時。SD大鼠分籠喂養，飼料與墊料均經消毒處理，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，墊料每日更換一次，保持墊料干燥。飲用水經煮沸后冷卻至室溫提供給動物。

1.1.2 實驗藥品

芪柏愈瘍油：中藥飲片由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院藥劑科提供，黃芪、黃柏、大黃、白芷、赤芍、血竭等藥物按比例配伍，制成濃度為每1mL含生藥0.85g的黃色澄清液體，密封保存。

復方紫草油：由紫草、冰片、忍冬藤、白芷組成，輔料為麻油。性狀為紫紅色澄清液體，規格為30mL/瓶。武漢健民集團葉開泰國藥(隨州)有限公司，國藥準字Z20044385，產品批號171242。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病大鼠潰瘍模型的建立

(1)糖尿病大鼠模型的建立

雄性SD大鼠80只，隨機分為空白對照組(NC組)16只，糖尿病組(DM組)64只。所有大鼠適應性喂養1周后，于第2周注射STZ溶液，注射前所有SD大鼠需要禁食不禁水12h，造模當日稱取所有大鼠體重，尾靜脈采血測定基礎血糖。按照65mg/kg的劑量對DM組大鼠一次性腹腔注射配制好的STZ溶液，建立糖尿病大鼠模型；對NC組大鼠腹腔注射等容積的0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。各組大鼠于注射STZ溶液1小時后自由進食進水，之后每日給予大鼠充足飲水和攝食，保持墊料干燥。注射STZ溶液后3天、5天、7天分別檢測大鼠尾靜脈隨機血糖，血糖值2次或2次以上≥16.7mmol/L，則判定糖尿病大鼠模型造模成功[3]。

(2)糖尿病大鼠潰瘍模型的建立

成功建立糖尿病大鼠模型2周后制作糖尿病大鼠潰瘍模型，造模前12小時所有大鼠禁食不禁水，造模前3小時禁水，按0.3mL/100g的劑量對所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液進行麻醉。將麻醉后的大鼠俯臥位放在固定板上，固定住四肢，剪毛備皮，背部正中偏左側做直徑為2.0cm ×2.0cm的圓形標記，無菌條件下用剪刀剪去標記處全層皮膚(深達肌肉)，止血后用生理鹽水沖洗創面[4]。

1.2.2 分組

未注射STZ溶液的大鼠為空白對照組(NC組)，將造模成功的糖尿病大鼠隨機分為模型組(MG組)，芪柏愈瘍油組(TG1組)、復方紫草油組(TG2組)。

1.2.3 給藥方法

(1)空白對照組(NC組)與模型組(MG組)給藥方法：碘伏消毒后，局部清創，用生理鹽水完全浸漬后覆蓋創面，外用無菌敷貼纏繞包扎，每天換藥一次。

(2)芪柏愈瘍油組(TG1組)給藥方法：碘伏消毒，局部清創后，用生理鹽水潤洗創面，將含有芪柏愈瘍油藥液的紗布濕敷于大鼠創面，外用無菌敷貼纏繞包扎，每天換藥一次。

(3)復方紫草油組(TG2組)給藥方法：碘伏消毒，局部清創后，用生理鹽水潤洗創面，將含有紫草油藥液的紗布濕敷于大鼠創面，外用無菌敷貼纏繞包扎，每天換藥一次。

圖1 IL-1β免疫組化染色結果(200×)

1.2.4 取材

在用藥后7、14天，將大鼠麻醉后，剪取大鼠創面組織(包括創面周圍正常皮膚組織)，將組織置于無菌細胞凍存管中，于液氮中速凍后轉移至-80 0C冰箱中保存，用于免疫組化檢測。

1.2.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，數據以均數±標準差(±s)表示，組間差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間方差齊采用LSD法，方差不齊采用Tamhane's T2(M)法，以P＜0.05為具有統計學意義。繪圖采用Graphpad 7.0軟件。

2 結果

2.1 免疫組化檢測創面組織中IL-1β的表達情況

用藥后7、14天，與空白對照組(NC組)大鼠相比，糖尿病各組(MG組、TG1組和TG2組)大鼠創面組織中IL-1β表達水平明顯增加(P＜0.05)，芪柏愈瘍油組(TG1組)與復方紫草油組(TG2組)大鼠創面組織中IL-1β表達水平明顯低于MG組(P＜0.05)，TG1組和TG2組未見明顯差異。見圖1、2。

圖2 IL-1β陽性目標面密度值比較

3 討論

研究表明在糖尿病足潰瘍創面中IL-1β處于持續高表達的狀態，導致創面炎癥反應異常[5,6]，是已知的最強的促炎細胞因子之一。IL-1β與其I型受體結合后，不但能增加自身的表達，形成自我放大的細胞因子網絡，還能夠促進多種靶蛋白的磷酸化，促使NF-κB入核，增強促炎因子的表達，使炎癥細胞浸潤異常增多，放大炎癥反應，并且持續較長時間，損傷血管內皮細胞，使創面修復停滯不前，阻斷IL-1β被明，創面炎癥反應的吸收與消散明顯加快，順利過渡到增殖期，從而促進創面愈合[8]。

此次研究中發現糖尿病大鼠潰瘍創面組織中出現炎癥細胞浸潤增加，消退延遲的病理現象，經檢測創面組織發現IL-1β等炎性細胞因子異常分泌。模型組(MG組)大鼠潰瘍創面在7天時炎癥反應最重，14天時仍存在較多炎性細胞，出現炎癥反應消退延遲的現象。用藥后，芪柏愈瘍油組(TG1組)與復方紫草油組(TG2組)大鼠創面組織中IL-1β的表達水平較模型組明顯降低，在藥物干預后的7天到14天炎性細胞因子的表達水平不斷降低，炎癥反應逐漸消退，使創面微環境得到改善，從而促進創面的愈合。