HPLC法測定鹽酸羅哌卡因注射液中2,6-二甲基苯胺

王濤，高園霞，王發(fā)，劉雪峰

(1.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安；2.西安力邦制藥有限公司，陜西 西安)

0 引言

鹽酸羅哌卡因注射液本品主要成份為鹽酸羅哌卡因，適用于外科手術麻醉[1-3]。鹽酸羅哌卡因化學名稱：(S)-(-)-1-丙基-N-(2，6-二甲基苯基)-2-哌啶甲酰胺甲磺酸鹽一水合物，2，6-二甲基苯胺系鹽酸羅哌卡因注射液生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的有關物質(zhì)，可引起高鐵血紅蛋白血癥，造成組織缺氧；對中樞神經(jīng)系統(tǒng)及肝臟損害較強，極易經(jīng)皮膚吸收，可引起皮炎；常用危險化學品的分類及標志(GB 13690-92)將該物質(zhì)劃為第6.1類毒害品；2，6-二甲基苯胺在世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)公布的致癌物清單2B類致癌物清單中。

為了更精準的控制2，6-二甲基苯胺含量，最大程度的降低該藥品在日常使用的過程中產(chǎn)生的毒副作用，本文以高效液相色譜法測定鹽酸羅哌卡因注射液中2，6-二甲基苯胺，結(jié)合中國藥典以及參考相關文獻[4-10]，建立了高效液相色譜法測定鹽酸羅哌卡因注射液中有關物質(zhì)2，6-二甲基苯胺的定量方法。方法學結(jié)果表明本方法簡便易行，精密度高，重現(xiàn)性好，具有很好的可行性，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供較高的參考性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國Waters公司高效液相色譜儀(Alliance E2695色譜系統(tǒng)，2489紫外檢測器，Empower工作站)，瑞士梅特勒公司ME204型、XPE105型全自動電子分析天平，超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司，KQ-500DE型)

1.2 試藥

試藥：鹽酸羅哌卡因?qū)φ掌?中國藥品生物制品檢定研究院，批號100866-201302)；2，6-二甲基苯胺對照品(中國藥品生物制品檢定研究院，批號100868-200801)；鹽酸羅哌卡因注射液(西安力邦制藥公司生產(chǎn)，批號：1405011、1405012、1405013)；試劑：磷酸二氫鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20140311)分析純；磷酸(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20141225)分析純；乙腈(霍尼韋爾公司，批號：S41A1H)色譜純；水為18.3ΜΩ·CM的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Diamonsil 5μm C18，250×4.6mm)；流動相：乙腈 - 磷酸鹽緩沖液 (取lmol·L-1 磷酸二氫鈉溶液 1.3mL，0.5mol·L-1 磷酸氫二鈉溶液 32.5mL，加水至 1000mL，調(diào)節(jié) pH 值至 7.0)(50：50)；檢測波長 240nm；柱溫：35℃；進樣量 20μL[4-5]。

2.2 溶液的制備

對照品溶液的制備：精密稱取2，6-二甲基苯胺對照品9.92mg，置100mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。量取該儲備液1mL，置500mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，作為2，6-二甲基苯胺對照品溶液。供試品溶液的制備：取本品適量，用加流動相溶解并定量稀釋制成每lmL中含鹽酸羅哌卡因2mg的溶液，作為供試品溶液。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 定位及空白溶液的考察

取“2.2”項下2，6-二甲基苯胺對照品溶液以及供試品溶液。按處方配制無鹽酸羅哌卡因的空白溶液，取上述3種溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白溶液不干擾2，6-二甲基苯胺的測定[6]。

2.3.2 破壞性試驗

(1)酸破壞試驗 取樣品溶液1mL，置10mL量瓶中，加入1mol·L-1鹽酸0.5mL混勻，室溫放置2小時，加適量氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性后，用流動相稀釋至刻度，作為酸破壞溶液。

(2)堿破壞試驗 取樣品溶液1mL，置10mL量瓶中，加入1mol·L-1氫氧化鈉溶液0.5mL混勻，室溫放置2小時，加適量鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性后，用流動相稀釋至刻度，作為堿破壞溶液。

(3)高溫破壞試驗 取樣品溶液1mL，置10mL量瓶中，60℃放置2小時，用流動相稀釋至刻度，作為高溫破壞溶液。

(4)氧化破壞試驗 取樣品溶液1mL，置10mL量瓶中，加入30%的過氧化氫溶液1mL放置6小時，用流動相稀釋至刻度，作為氧化破壞溶液。

(5)光破壞試驗 取樣品溶液1mL，置10mL量瓶中，置照度為4500LX下放置6小時，用流動相稀釋至刻度，作為光照破壞溶液。

量取上述各破壞后溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由各色譜圖可看出供試品經(jīng)堿、氧化破壞后可產(chǎn)生2，6-二甲基苯胺，表明樣品溶液在堿性、氧化環(huán)境下不穩(wěn)定；酸、堿、氧化、光、熱破壞后產(chǎn)生的其它雜質(zhì)峰均不干擾鹽酸羅哌卡因及2，6-二甲基苯胺的測定[6-7]。

2.4 檢出限和定量限

取“2.2”項下儲備液，加流動相溶解并逐步稀釋，取20μL注入液相色譜儀，以S/N=10作為定量限，以S/N=3作為檢測限，測得2，6-二甲基苯胺的定量限為0.1984ng，檢測限為0.05952ng；證明該方法靈敏度良好，能有效滿足測定需要。

2.5 線性及范圍

取“2.2”項下儲備液，量取該儲備液1mL，置100mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，作為濃對照溶液。量取該濃對照溶液1mL，分別置100、20、10mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，依次作為對照品溶液(1)、(2)、(3)。量取該濃對照溶液3mL，置20mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，作為對照品溶液(4)；量取該濃對照溶液1mL，置5mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，作為對照品溶液(5)；該濃對照溶液5mL，置20mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，作為對照品溶液(6)。量取上述6個溶液各精密量取20μL，分別注入液相色譜儀中，以濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，計算回歸方程：y=96561x+19.299，回歸系數(shù)：r=0.9999。結(jié)果表明，在0.00992μg·mL-1至 0.248μg·mL-1的范圍內(nèi)，2，6- 二甲基苯胺的濃度與峰面積呈良好的線性關系[8]。

圖1 HPLC色譜圖

圖2 破壞實驗色譜圖

表1 2,6-二甲基苯胺線性測定結(jié)果

2.6 精密度

取“2.2”項下2，6-二甲基苯胺對照品溶液，取上述對照溶液20μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，各圖譜中2，6-二甲基苯胺峰面積RSD為0.25%，結(jié)果表明，本測定方法的進樣精密度良好[9]。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗

取“2.2”項下2，6-二甲基苯胺對照品溶液，分別在0小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時各取20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，溶液在24小時室溫放置，樣品峰面積基本不變，各圖譜中2，6-二甲基苯胺峰面積RSD為0.16%。結(jié)果表明，本法測定2，6-二甲基苯胺具有良好的穩(wěn)定性[10]。

2.8 回收實驗

精密稱取2，6-二甲基苯胺對照品10.86mg，置100mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照儲備液。量取該儲備液1mL，置100mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，作為對照溶液。量取該儲備液1mL，置50mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，取該溶液1mL、量取批號為1405011樣品2mL至10mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試液，平行制備6份。量取上述6個供試樣品溶液和對照溶液各20μL注入高效液相色譜儀，按外標法以峰面積計算2，6-二甲基苯胺的加樣回收率，結(jié)果表明，本法測定2，6-二甲基苯胺準確度高。

表2 2,6-二甲基苯胺回收率測定結(jié)果

表3 2,6-二甲基苯胺測定結(jié)果

2.9 耐用性

取1405011批溶液1mL，置10mL量瓶中，加入1mol·L-1氫氧化鈉溶液0.5mL混勻，室溫放置過夜，使其破壞，產(chǎn)生有關物質(zhì)2，6-二甲基苯胺，加適量鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性后，用流動相稀釋至刻度，作為供試品溶液，量取該溶液20μL，分別在 20、25、30、35、40℃柱溫條件下注入色譜儀，記錄色譜圖，比較不同柱溫下鹽酸羅哌卡因和2，6-二甲基苯胺峰的分離情況。由結(jié)果可看出5種條件下，柱溫的變化對兩個物質(zhì)分離情況無影響，該方法對溫度耐用性良好。

2.10 樣品檢測

取三批樣品 (批號：1405011、1405012、1405013)，照“2.2”項下制成供試品溶液以及2，6-二甲基苯胺對照品溶液，取以上兩種溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，按外標法計算，2，6-二甲基苯胺不得過標示量的0.01%，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

為了能夠確保各組分可以完全分離且分離度較好，故選用長的色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Diamonsil 5μm C18，250×4.6mm)；為了得到更好的分離條件和峰型，我們曾將磷酸鹽緩沖液pH調(diào)為6.0、6.2、6.5、7.0、7.2等多種流動相進行試驗，經(jīng)過綜合考慮和分析，當流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液 (取 lmol·L-1磷酸二氫鈉溶液 1.3mL，0.5mol·L-1磷酸氫二鈉溶液32.5mL，加水至1000mL，調(diào)節(jié)pH 值至7.0)(50：50)時，樣品穩(wěn)定性好，各峰之間分離度、保留時間、理論塔板數(shù)、拖尾因子等最為理想。

3.2 波長的選擇

取“2.2”項下儲備液，加流動相稀釋10倍，在200～350nm下做紫外掃描，結(jié)果2，6-二甲基苯胺在240nm附近有最大吸收，故檢測波長定為240nm。