低分子肝素鈉創面下注射對深二度燒傷創面早期進行性損害的影響

陳賓，況芳，李桂強，趙婧楠，蔣航，黃益凡，李孝建(通訊作者*)

(1.廣州市紅十字會醫院燒傷整形科，廣東 廣州；2.中山大學孫逸仙紀念醫院重癥醫學科，廣東 廣州)

0 引言

燒傷創面早期進行性損害是臨床普遍存在的現象，特別是深二度創面，一旦發生，可使殘存的真皮組織及皮膚附件遭到進一步破壞，形成三度創面，同時損傷范圍向鄰近正常組織擴展，嚴重影響患者的預后和轉歸。創面局部過度炎癥反應和血栓形成被認為是燒傷創面早期發生進行性損害的重要原因。低分子肝素鈉是臨床常用的抗凝藥物，近年來，其抗炎特性越來越得到廣大研究者的關注。本研究擬通過創面下注射低分子肝素鈉來觀察其對燒傷創面早期進行性損害的影響并初步探討其相關機制，為臨床防止燒傷創面早期加深提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 大鼠深二度梳狀燙傷動物模型建立

40只雄性SD大鼠(180-220g)，制作模型前適應性喂養一周，術前禁食12小時。稱重后腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(40mg/kg)麻醉大鼠。電動剃毛刀剃毛后脫毛劑脫毛。建模前先用恒溫水浴鍋將水加熱至80℃并保持恒溫，將黃銅梳狀燙傷模具放入熱水中加熱15秒，然后，用燙傷模具分別于大鼠兩側背部持續燙傷8秒(模具無附加壓力接觸皮膚)建立深二度燙傷創面，經病理組織檢查證實為深二度創面。一側背部形成四個1cm×2cm大小矩形創面，兩個創面之間形成一個0.5cm×2cm大小矩形正常皮膚。

1.2 實驗分組、時相點設置及創面處理

大鼠隨機分為燙傷對照組和燙傷+低分子肝素鈉干預組，每組各 20只。設置傷后 6h、12h、24h、48h和 72h共 5個觀察時相點，每組每個時相點4只大鼠。燙傷對照組每個創面下注射0.5mL生理鹽水，燙傷+低分子肝素鈉干預組每個創面下注射0.5mL 5000IU/mL的低分子肝素鈉生理鹽水溶液。

1.3 標本采集

大鼠麻醉后，經頸椎脫臼處死。用手術剪剪下背部創面及瘀滯區皮膚，同時清除皮下肉膜。組織標本先用0.9%NS洗凈，用于制作石蠟切片的標本用10%福爾馬林溶液固定，而其余組織標本則放置于標本凍存盒中液氮中凍存以待后續實驗用。

1.4 創面組織石蠟切片制作及形態學觀察

將10%福爾馬林溶液固定皮膚組織標本制成石蠟切片。石蠟切片經蘇木素-伊紅(HE)染色及Masson染色，分別觀察表皮、真皮及皮膚附件情況，創面炎癥細胞浸潤情況和血管栓塞情況。

1.5 創面深度測量

Masson染色中紅色代表組織壞死，研究中可以通過測量切片中瘀滯區組織兩個邊緣及中心的組織損傷深度，最后得出一個平均深度。

1.6 創面組織炎癥因子及MPO含量測定

本部分實驗主要應用IL-1β ELISA檢測試劑盒、IL-6 ELISA檢測試劑盒及TNF-αELISA檢測試劑盒(均為美國Raybiotech公司生產)來檢測瘀滯區組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-6等的含量。應用美國Abcam 公司生產的MPO ELISA試劑盒檢測組織中MPO含量。

1.7 統計學方法

應用美國IBM公司的SPSS 22統計軟件對本次實驗的數據進行統計分析。統計結果主要以均數±標準差(±SD)形式表示，組間比較，兩組間采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 大鼠深二度燙傷動物模型的建立與評價

本實驗應用國內外廣泛用于研究燒傷創面早期進行性損害的黃銅梳狀模具通過熱接觸的形式建立深二度燙傷動物模型(見圖1a)。于每只大鼠背部兩側分別建立4個1cm×2cm大小燙傷創面，每側背部燙傷創面之間共形成3條0.5cm×2cm大小瘀滯帶(見圖1b)。留取燙傷創面組織標本行病理學檢查，證實為深二度燙傷(見圖1c，1d)。

2.2 創面炎癥浸潤情況(HE染色)和壞死深度(Masson染色)觀察與比較

創面及瘀滯區組織切片HE染色顯示，燙傷對照組局部殘留的毛囊、汗腺等皮膚附件結構明顯減少，組織明顯充血水腫，部分膠原纖維變性、斷裂，壞死組織與正常組織交界處可見大量炎性細胞浸潤而成的一條炎癥帶。燙傷+低分子肝素鈉干預組皮膚殘留的皮膚附件較燙傷對照組數量明顯增多，結構完整；組織發生充血、水腫和創面及瘀滯區組織炎性細胞浸潤程度明顯減輕。Masson染色見燙傷+低分子肝素鈉干預組紅色染色區域范圍及深度明顯小于燙傷干預組。通過定量分析測量損傷深度見從傷后12小時起，燙傷對照組瘀滯區損傷平均深度明顯深于燙傷+低分子肝素鈉干預組，差異具有統計學意義(P＜0.05)(見表1)。

2.3 瘀滯區組織IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子及MPO含量測定

通過ELISA檢測試劑盒檢測燙傷后各時間點瘀滯區組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及髓過氧化物酶MPO的含量變化。研究發現，燙傷對照組與燙傷+低分子肝素鈉干預組大鼠瘀滯區組織在傷后各時間點炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α以及MPO均大量表達及釋放。燙傷+低分子肝素鈉干預組創面IL-1β含量與燙傷對照組比較，傷后12h兩組間比較差異即有統計學意義(P=0.028)，而傷后24h、48h及72h兩組間比較差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；IL-6兩組間比較，傷后6h、12h差異無統計學意義(P＞0.05)，傷后24h、48h及72h差異均有統計學意義；TNF-α含量兩組間比較，傷后 6h、12h 差異無統計學意義 (P＞0.05)，傷后 24h、48h及72h差異均有統計學意義；MPO含量兩組間比較，傷后6h、12h及72h差異無統計學意義(P＞0.05)，傷后24h及48h差異均有統計學意義(見表2)。

圖1 a：黃銅梳狀燙傷模具圖1b：于大鼠一側背部建立4條矩形燙傷創面，創面之間為3條瘀滯帶圖1c：創面組織HE染色圖1d 創面組織Masson染色，紅色代表組織壞死區域。

3 討論

燒傷創面早期進行性損害現象最常見于深二度創面，因而深二度創面也一直是臨床研究的重點[1,2]。目前國內外主要選擇熱接觸方式制作深二度創面，現廣泛應用于研究燒傷創面早期進行性損害機理研究的動物模型主要有兩種[3,4]：大鼠梳狀燙傷動物模型和大鼠大面積燙傷動物模型(TBSA≥30%)。本實驗采用大鼠梳狀燙傷動物模型，主要為了減少大面積燒傷后循環因素對局部創面的影響。通過黃銅梳狀模具在80℃熱水中浸泡8秒，之后與創面無壓力接觸10秒后形成燙傷創面，創面標本行病理檢查證實為深二度創面。兩個燙傷創面之間的區域即本實驗研究的重點瘀滯區。本動物在我們的研究中也證實操作簡單，穩定性好，比較適合用于研究深二度燒傷創面早期進行性損害的發生機理。

表1 大鼠皮膚組織壞死深度(um，±SD)

表1 大鼠皮膚組織壞死深度(um，±SD)

注 *P＜0.05，** P＜0.01。

組別 傷后6h 傷后12h 傷后24h 傷后48h 傷后72h燙傷對照組 232.08±18.17 260.25±14.82 308±15.36 367±20.24 401.5±19.47燙傷+低分子肝素鈉干預組 228.42±20.64 246.58±10.55* 274±13.89** 311.25±20.87** 345.67±21.47**

既往的研究發現，燒傷創面早期進行性損害現象往往發生于傷后72h內，早在傷后3小時即可發生，傷后6小時即可肉眼觀察到瘀滯區變化并持續到48h至72h[5]。因此，本實驗將觀察點設置為傷后6h、12h、24h、48h及72h 5個點。我們的研究中亦發現，皮膚深燙傷6小時后，燙傷對照組大鼠瘀滯區皮膚部分即開始變成暗棕褐色或黑色，隨著時間推移，棕褐色及黑色區域逐漸擴大，另外Masson染色也發現，組織損傷的深度和范圍也隨著時間推不斷加深、擴大。傷后48h之后壞死區域進展的速度明顯減緩，壞死面積逐漸趨于穩定。應用低分子肝素鈉干預后，瘀滯區皮膚在傷后6小時之后雖也可觀察到燙傷對照組變成棕褐色或黑色，隨著時間推移，暗紫色及黑色區域逐漸擴大，壞死深度及不斷加深的現象。證實低分子肝素鈉能減輕燒傷創面早期發生進行性損害。

表2 瘀滯區組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及MPO的含量

中性粒細胞在凝血和血栓形成過程中起到關鍵性作用，研究發現，通過有效手段耗竭中性粒細胞后，實驗性血栓形成過程遭到逆轉[6]。中性粒細胞是燒傷后已知的第一個浸潤創面的炎癥細胞并在傷后持續數周[7]。髓過氧化物MPO是反映中性粒細胞活化及功能狀態的標志，其水平及活性高低反映著中性粒細胞的功能和活性狀態。我們的研究發現，傷后瘀滯區MPO含量顯著升高，我們通過應用低分子肝素鈉干預后，MPO顯著降低，瘀滯區炎癥細胞浸潤及微血栓形成數量明顯減少。提示，低分子肝素鈉能減輕燒傷創面早期發生進行性損害的機理可能與其減輕局部過度炎癥反應及血栓形成密切相關。

近年來，隨著肝素的抗炎特性得到越來越多的研究證實[8,9]，其在預防燒傷創面早期進行性損害方面也取得了較好的效果，然而，目前大部分研究還是以動物實驗為主，臨床結果并未取得預期效果，其使用的時機及劑量還有待于進一步深入研究。