Eplet匹配對腎移植術后供者特異性抗體產生及急性排斥反應發生的影響

匡培丹，張璇，張穎，丁小明，薛武軍，雷艷君，鄭瑾

西安交通大學第一附屬醫院，西安710061

腎移植是終末期腎病的一種有效治療手段，但腎移植術后供者特異性抗體(DSA)產生和急性排斥反應發生可導致移植腎失功能。因此，移植腎長期存活仍然是目前移植領域亟待解決的問題之一[1-2]。組織配型技術的快速發展，使器官移植供受者選擇達到了更為精準的層面。近年來，在腎移植領域涌現出了大量關于人類白細胞抗原(HLA)功能性表位(Eplet)的報道[3-4]。研究發現，HLA匹配程度與腎移植長期存活密切相關[5]。良好的HLA匹配，不僅可減少腎移植患者免疫抑制劑應用劑量，還可降低患者致敏程度[6]。目前，臨床器官移植主要的HLA匹配方式有HLA抗原匹配、氨基酸殘基(Res M)匹配和HLA Matchmaker匹配。HLA抗原匹配和Res M匹配僅需要HLA血清學分型結果，方法相對簡單，易操作。然而，就單個移植中心而言，由于供受者樣本池太小，獲得良好供受者HLA抗原匹配的概率非常低。Res M匹配基于交叉反應組[7]，能夠提高供受者良好的匹配概率，但對于致敏受者預存的供者DSA無法有效避開。HLA Matchmaker匹配基于HLA抗原氨基酸序列上的Eplet，需要分析供受者HLA基因分型，方法較為復雜，耗費時間較長。Eplet匹配將HLA抗原描述為一系列抗體靶點或表位，相對于HLA抗原匹配或Res M匹配，能夠提供一個更結合臨床實際的HLA匹配系統，從而降低了移植后致敏的風險，避免了移植術后急性排斥反應的發生[8]。但目前國內關于腎移植Eplet匹配的研究報道較少。本研究探討了Eplet匹配對腎移植術后DSA產生及急性排斥反應發生的影響，旨在揭示Eplet匹配在腎移植組織配型中的應用價值。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月—2018年6月在西安交通大學第一附屬醫院實施腎移植術患者787例。納入標準：①首次接受腎移植術；②年齡18～65歲；③術前群體反應性抗體(PRA)陰性；④術后接受免疫抑制劑治療；⑤臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：①合并急慢性感染性疾病者；②合并心、肝、肺等重要臟器嚴重疾病者；③合并惡性腫瘤者；④術后出現急性排斥反應者；⑤治療依從性差者。根據供者來源分為公民逝世后捐獻即死亡捐獻(DD)632例和親屬活體捐獻(LRD)155例。DD受者男455例、女177例，年齡(36.05±9.01)歲，BMI(20.40±2.95)kg/m2，透析齡(13.01±7.20)個月，原發病：慢性腎炎362例、IgA腎病91例、膜性腎病81例、高血壓腎病67例、其他31例；LRD受者男127例、女28例，年齡(26.13±6.01)歲，BMI(21.60±1.97)kg/m2，透析齡(9.13±3.51)個月，原發病：慢性腎炎92例、IgA腎病21例、膜性腎病18例、高血壓腎病16例、其他8例。DD供者男508例、女124例，年齡(44.98±11.36)歲，BMI(21.80±2.43)kg/m2，原發病：腦外傷296例、腦出血294例、腦膠質瘤24例、其他18例；器官獲取前血清Scr(107.86±80.34)μmol/L，熱缺血時間(4.58±1.67)min，冷缺血時間(8.74±3.58)h；LRD供者男76例、女79例，年齡(46.45±4.36)歲，BMI(22.7±3.05)kg/m2，器官獲取前血清Scr(69.38±10.52)μmol/L，熱缺血時間(2.13±0.57)min，冷缺血時間(1.14±0.34)h。DD受者與LRD受者年齡、透析齡比較P均<0.05，其余臨床資料比較P均>0.05；DD供者與LRD供者性別、血清Scr水平、熱缺血時間、冷缺血時間比較P均<0.05，年齡、BMI比較P均>0.05。本研究符合醫學倫理學標準，并經西安交通大學第一附屬醫院人體器官移植臨床倫理委員會批準。研究對象或其家屬知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 研究方法 腎移植前采用LABType SSO HD試劑盒對供受者HLA Ⅰ類(A、B、C位點)和Ⅱ類(DR、DQ位點)抗原進行高分辨分型，采用LABType SSO試劑盒進行中分辨分型，經Fusion軟件分析獲取供受者HLA抗原基因分型和血清學分型信息。

供受者在腎移植手術前進行HLA抗原匹配和Res M匹配。HLA抗原匹配根據供受者實際HLA抗原血清學分型的位點進行人工對比匹配，供受者HLA抗原位點完全相同視為匹配，否則視為不匹配；Res M匹配根據供受者HLA抗原血清學分型位點所在的CREA進行匹配[7]，如供受者HLA抗原在同一CREA視為匹配，否則視為不匹配。Eplet匹配根據供受者HLA抗原基因分型位點，采用HLA Matchmaker軟件(Version 2.1，available from: www.hlamatchmaker.net)進行供受者Eplet匹配錯配數分析，如供受者HLA抗原氨基酸序列上的Eplet相同視為匹配，否則視為不匹配。

1.3 腎移植術后免疫抑制治療與隨訪 腎移植手術期間和腎移植術后1～4 d予抗人胸腺細胞球蛋白50 mg/d、甲基強的松龍250 mg/d誘導治療。腎移植術后接受三聯免疫抑制方案治療：他克莫司0.1 mg/(kg·d)或環孢霉素4.5～5.0 mg/(kg·d)，甲基強的松龍10～20 mg/d；腎移植術后第1天嗎替麥考酚酯1.5～2.0 g/d。環孢霉素或他克莫司與甲基強的松龍在誘導治療最后1 d同步給藥。

腎移植術后門診定期隨訪，分別于第4、12、26、52周，留取血清樣本，采用LABScreen Mix試劑盒檢測PRA。如果PRA陽性，采用LABScreen Single Antigen試劑盒進一步檢測HLA Ⅰ、Ⅱ類DSA，并評估樣品中每個微珠的平均熒光強度(MFI)。MFI峰值≥1 000為陽性。

1.4 急性排斥反應判斷 急性排斥反應的臨床診斷根據《腎移植排斥反應臨床診療技術規范(2019版)》[9]。移植腎組織抗體介導的排斥反應(AMR)、細胞介導的排斥反應(TCMR)、AMR+TCMR病理診斷依據《Banff-2017移植腎病理分類方案》。

2 結果

2.1 供受者Eplet匹配錯配數與HLA Res M匹配、HLA抗原匹配錯配數的關系 供受者HLA A、B、C、DR、DQ位點Eplet匹配錯配數為62.18±21.62，HLA A、B、DR位點Eplet匹配錯配數為50.59±17.00。供受者HLA A、B、DR位點Res M匹配錯配數為1.84±1.00，A、B、C、DR、DQ位點HLA抗原匹配錯配數為8.05±1.58。Pearson相關分析顯示，供受者HLA A、B、DR位點Eplet匹配錯配數與Res M匹配錯配數呈正相關關系(r=0.226，P<0.01)，供受者HLA A、B、C、DR、DQ位點Eplet匹配錯配數與HLA抗原匹配錯配數亦呈正相關關系(r=0.475，P<0.01)。

2.2 LRD與DD供受者HLA匹配效果比較 LRD與DD供受者Eplet匹配錯配數分別為43.94±19.86、66.65±19.60，二者比較P<0.01。見表1。

表1 LRD與DD供受者HLA匹配效果比較

2.3 LRD與DD移植術后HLA抗體產生和急性排斥反應發生情況比較 LRD受者腎移植術后PRA陽性率為5.16%(8/155)、DSA陽性率為1.29%(2/155)，DD受者腎移植術后PRA陽性率為12.50%(79/632)、DSA陽性率為3.48%(22/632)，LRD受者腎移植術后PRA、DSA陽性率均低于DD受者(P均<0.01)。LRD受者腎移植術后急性排斥反應的發生率為3.23%(5/155)，DD受者腎移植術后急性排斥反應的發生率為9.65%(61/632)，DD受者腎移植術后急性排斥反應的發生率高于LDR受者(P<0.01)。

2.4 Eplet匹配錯配數與腎移植術后HLA抗體產生的關系 PRA陽性與陰性受者Res M匹配錯配數分別為2.11±1.13、1.80±0.41，二者比較P<0.05；DSA陽性與陰性受者Res M匹配錯配數分別為2.08±1.14、1.81±0.45，二者比較P<0.05。PRA陽性與陰性受者HLA抗原匹配錯配數分別為8.04±1.73、8.05±1.82，二者比較P>0.05；DSA陽性與陰性受者HLA抗原匹配錯配數分別為8.09±1.09、8.03±1.54，二者比較P>0.05。PRA陽性與陰性受者Eplet匹配錯配數分別為72.12±21.73、61.08±21.34，二者比較P<0.05；DSA陽性與陰性受者Eplet匹配錯配數分別為73.00±20.42、61.97±21.59，二者比較P<0.05。

2.5 Eplet匹配錯配數與腎移植術后急性排斥反應發生的關系 787例接受腎移植患者術后急性排斥反應的發生率為8.39%(66/787)，其中AMR為3.05%(24/787)、TCMR為3.94%(31/787)、AMR+TCMR為1.40%(11/787)。急性排斥反應陽性與陰性受者Res M匹配錯配數分別為1.87±0.82、1.84±1.01，HLA抗原匹配錯配數分別為8.36±1.19、8.04±1.59，二者比較P均>0.05。急性排斥反應陽性與陰性受者Eplet匹配錯配數分別為72.17±21.04、61.58±21.48，二者比較P<0.05。

2.6 Eplet匹配錯配數對腎移植術后DSA產生和急性排斥反應發生的預測效能 HLA抗原匹配錯配數預測腎移植術后DSA產生的曲線下面積(AUC)為0.673(95%CI：0.527～0.775，P<0.05)，其截斷(cut off)值為8.50，此時其預測腎移植術后DSA產生的敏感度為71%、特異度為55%；Res M匹配錯配數預測腎移植術后DSA產生的AUC為0.613(95%CI：0.505～0.720，P>0.05)；Eplet匹配錯配數預測腎移植術后DSA產生的AUC為0.719(95%CI：0.621～0.817，P<0.05)，其cut off值為78.59，此時其預測腎移植術后DSA產生的敏感度為71%、特異度為79%。

HLA抗原匹配錯配數預測腎移植術后急性排斥反應發生的AUC為0.612(95%CI：0.522～0.701，P<0.05)，其cut off值為8.50，此時其預測腎移植術后急性排斥反應發生的敏感度為68%、特異度為57%；Res M匹配錯配數預測腎移植術后急性排斥反應發生的AUC為0.502(95%CI：0.414～0.590，P>0.05)；Eplet匹配錯配數預測腎移植術后急性排斥反應發生的AUC為0.737(95%CI：0.646～0.828，P<0.05)，其cut off值為75.43，此時其預測腎移植術后急性排斥反應發生的敏感度為70%、特異度為78%。

3 討論

腎移植是目前終末期腎病最佳的替代治療方法，但腎移植術后受者DSA產生和急性排斥反應發生可導致移植腎失功能。目前認為，DSA產生和急性排斥反應發生的原因包括HLA不完全匹配、免疫抑制劑治療劑量不足、移植腎功能延遲恢復等，其中HLA不完全匹配是DSA產生和急性排斥反應發生的直接原因。

HLA是宿主免疫系統識別的主要組織相容性抗原。以往研究認為，HLA Ⅰ類抗原不匹配是LRD腎移植臨床效果不佳的預測因子，但在DD腎移植中并不重要[5]。隨著HLA DR位點的發現，HLA抗原不匹配對DD腎移植的影響得到了證實[10]。即使是在鈣調神經抑制劑的免疫抑制療法時代，HLA A、B、DR位點匹配情況與移植物存活率仍存在明顯的線性關系[11]。體液免疫被認為是導致慢性同種異體移植物丟失的最主要原因[12]。HLA抗原不匹配是新生HLA特異性抗體產生的危險因素，同時又與較差的移植物存活率及移植術后致敏作用增強密切相關[13]。因此，良好的供受者HLA匹配是組織器官移植的基礎。1987年美國器官分配聯合網制定了強制性HLA六抗原匹配腎臟分享政策，要求ABO血型相容和HLA六個抗原相配的腎臟在全國范圍內共享。按零抗原錯配標準選擇供受者的腎移植能夠獲得較為理想的1、5、10、20年腎存活率，但能夠達到六抗原相配的腎移植僅占2%～5%。由于我國各移植中心供受者的樣本池太小，能夠達到零抗原錯配標準的腎移植比例更低。因此，HLA抗原錯配標準的臨床實用性受到很大限制。1996年，TAKEMOTO研究團隊對近4萬例尸體腎移植進行隨訪分析，提出了一種新的配型策略——Res M匹配，又稱交叉反應組配型[7]。目前，我國多數器官移植中心認同HLA Ⅰ、Ⅱ類Res M配型標準[14]。但由于Res M配型標準基于HLA抗原血清學分型交叉反應組，對致敏受者體內預存的DSA無法有效避開。

抗原表位是結合DSA所需的最小結構決定因素。抗體的抗原結合位點是由輕鏈和重鏈的可變區域配對形成的。近年研究發現，抗原抗體結合的特異性主要是由2～5個氨基酸組成的集群決定，稱之為Eplet[15]。DUQUESNOY團隊基于HLA Matchmaker軟件(www.epitopes.net)分析供者所含有的非受者自身Eplet個數發現，Eplet個數能夠預測移植術后DSA產生的概率，并且其預測DSA產生概率的準確性明顯優于HLA抗原匹配錯配數和Res M匹配錯配數[15-17]。

本研究結果顯示，供受者Eplet匹配錯配數與傳統組織配型方法HLA抗原匹配錯配數、Res M匹配錯配數均密切相關；LRD供受者各位點Eplet匹配錯配數均低于DD供受者各位點Eplet匹配錯配數，與LIM等[8]報道基本一致。本研究結果還發現，腎移植術后PRA、DSA陽性受者Eplet匹配錯配數均高于其陰性受者；同樣，腎移植術后發生急性排斥反應受者Eplet匹配錯配數高于未發生急性排斥反應受者。雖然Res M匹配錯配數在腎移植術后PRA、DSA陽性受者與PRA、DSA陰性受者存在統計學差異，但是其在發生急性排斥反應受者與未發生急性排斥反應受者之間并無統計學差異，而HLA抗原匹配錯配數在腎移植術后PRA陽性與陰性、DSA陽性與陰性以及發生與未發生急性排斥反應受者之間均無統計學差異。但在相同條件下，基于Eplet匹配錯配數的分析結果卻能與DSA產生和急性排斥反應發生有關，并且Eplet匹配錯配數對腎移植術后DSA產生及急性排斥反應發生的預測價值明顯優于HLA抗原匹配錯配數和Res M匹配錯配數。結果表明Eplet匹配錯配數與HLA抗原匹配錯配數、Res M匹配錯配數具有一定關系，并且較傳統組織配型方法更靈敏。但Eplet匹配的臨床應用還有一些問題亟待解決。首先，高分辨率的HLA分型是確定HLA抗原表位的必要條件。其次，需要一個能定義完整Eplet表位的健全系統。雖然DUQUESNOY團隊的Eplet是最佳的候選產品，但所有Eplet的生物學相關性和相對免疫原性還有待進一步確定。

綜上所述，供受者Eplet匹配錯配數與HLA抗原匹配錯配數和Res M匹配錯配數密切相關，并可影響腎移植受者術后DSA產生和急性排斥反應發生。Eplet匹配較傳統組織配型方法更靈敏，具有更廣泛的臨床應用前景。