Irisin對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢胰島素抵抗的影響

周麗，李成剛，巫小云，馮澤怡

1 湖北醫藥學院附屬東風醫院，湖北十堰442000；2 湖北醫藥學院藥學院；3 十堰市中西醫結合醫院

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡婦女常見的內分泌紊亂性疾病，是一種發病多因性、臨床表現多態性的內分泌失調綜合征，以月經失調、排卵障礙、雄激素過多、高胰島素血癥和胰島素抵抗為主要特征。PCOS確切的發病機制尚未完全闡明，國內外也未形成統一、有效的治療方案，使之成為當今婦科內分泌領域研究的熱點和難點。據報道，約70%的PCOS患者合并胰島素抵抗。因此，胰島素抵抗被認為是PCOS的重要病理生理特征[1]。近年研究發現，PCOS患者的胰島素抵抗不僅存在于骨骼肌、脂肪、肝臟等經典的胰島素靶組織或器官，也可存在于多囊卵巢組織內，有可能是卵巢功能障礙的重要機制之一[2-4]。鳶尾素(Irisin)是近年新發現的一種由肌肉組織分泌的細胞因子，具有促進白色脂肪棕色化和提高能量消耗的作用。YE等[5]認為，運動、能量代謝與胰島素抵抗密不可分，尤其是在2型糖尿病中。有研究證實，Irisin可降低血糖水平，改善胰島素抵抗，有可能成為治療2型糖尿病的一個潛在靶點[6-7]。此外，Irisin還能參與其他代謝相關性疾病的發生、發展，如代謝綜合征、非酒精性脂肪肝、糖尿病腎病等，并認為其作用機制可能是通過減輕胰島素抵抗實現的[8-9]。但Irisin能否改善PCOS患者卵巢胰島素抵抗尚不清楚。2018年1月—2019年7月，本研究觀察了Irisin對PCOS大鼠卵巢胰島素抵抗的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性SD大鼠45只，SPF級，4周齡，體質量70～90 g，由湖北醫藥學院動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK2016-0008。采用獨立通風籠具分籠飼養，飼養環境溫度22～25 ℃，相對濕度60%～70%，光照12 h明暗交替。所有大鼠正常攝食和飲水。實驗過程符合動物倫理學要求。重組人Irisin，購自北京百奧萊博科技有限公司；注射用脫氫表雄酮(DHEA)，購自湖北遠程藥業有限公司。全波長酶標儀，購自芬蘭雷勃公司；PCR儀，購自美國Bio-Rad公司。大鼠胰島素ELISA試劑盒，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。胰島素受體底物2(IRS-2)、葡萄糖轉運子4(Glut4)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)p85α單克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠二抗，購自武漢華美生物工程有限公司。TRIzol、逆轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 動物分組與干預 所有大鼠適應性飼養3 d，經陰道涂片觀察，將有正常動情周期大鼠納入實驗。采用隨機數字表法隨機將大鼠分為對照組、模型組、Irisin組，每組15只。模型組、Irisin組每日頸背部皮下注射DHEA 0.06 mg/g+0.2 mL注射油劑，對照組每日頸背部皮下注射等體積油劑，連續20 d；第21天開始，Irisin組每日腹腔注射重組人Irisin 100 ng/g，對照組和模型組每日腹腔注射等量生理鹽水，連續14 d。

1.3 血清胰島素檢測 模型組建模成功次日，對照組和Irisin組同期，采集清晨空腹狀態下眼眶靜脈血，3 000 r/min離心15 min、離心半徑15 cm，取上層血清，采用ELISA法檢測血清胰島素。各組末次腹腔注射后6 h處死，采集腹主動脈血，3 000 r/min離心15 min、離心半徑15 cm，取上層血清，采用ELISA法檢測血清胰島素。所有操作嚴格按ELISA試劑盒說明進行。

1.4 卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α表達檢測 無菌條件下摘取雙側卵巢，置于-80 ℃冰箱凍存。右側卵巢組織用于IRS-2、Glut4、PI3K p85α蛋白表達檢測，左側卵巢組織用于IRS-2、Glut4、PI3K p85α mRNA表達檢測。①IRS-2、Glut4、PI3K p85α蛋白表達檢測：采用Western blotting法。取右側卵巢組織，剪碎后加入含苯甲基磺酰氟的裂解液，冰上充分裂解。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，離心半徑15 cm，取上清，經BCA法蛋白定量合格。根據蛋白濃度，調整上樣量，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴使蛋白充分變性，以40 μg/孔在10% SDS-PAGE凝膠上電泳(100 V，2 h)。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜，然后用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入IRS-2、Glut4、PI3K p85α單克隆抗體(稀釋比均為1∶1 000)和內參β-actin一抗(稀釋比1∶1 500)，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠二抗(稀釋比1∶3 000)，常溫孵育1 h。ECL發光，暗室中曝光、顯影，采用凝膠成像分析系統采集各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。②IRS-2、Glut4、PI3K p85α mRNA表達檢測：采用RT-qPCR法。取左側卵巢組織，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續實驗。取總RNA 1 μg，以Oligo DT為引物，按PrimeScript RT Reagent Kit說明將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按Real-time PCR試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列：IRS-2上游引物5′-TGACCAGTCCCACATCAGGC-3′，下游引物5′-CTGCACGGATGACCTTAGCG-3′；Glut4上游引物5′-CTGTTGCCCTTCTGTCCTGA-3′，下游引物5′-CAACTTCCGTTTCTCATCCTTCA-3′；PI3K p85α上游引物5′-GGTGAGGAACGAAGAATGGC-3′，下游引物5′-TCCGAGGCAAGACAGGGATA-3′；β-actin上游引物5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。PCR反應體系共50 μL：Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2.5 μL，DNA模板 5 μL，滅菌雙蒸水15 μL；反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共35個循環，最后72 ℃ 10 min。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

2 結果

2.1 各組血清胰島素水平比較 見表1。

表1 各組不同時間血清胰島素水平比較

2.2 各組卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α蛋白表達比較 見表2。

表2 各組卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α蛋白相對表達量比較

2.3 各組卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α mRNA表達比較 見表3。

表3 各組卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α mRNA相對表達量比較

3 討論

PCOS是育齡期女性的常見病、多發病，是以高雄激素血癥、稀發排卵或無排卵、卵巢多囊樣改變等為主要表現的內分泌失調綜合征。文獻報道，約70%的PCOS患者合并胰島素抵抗，同時其胰島素敏感性降低35%～40%，與非胰島素依賴型糖尿病女性相似，故PCOS患者常常發展為代償性高胰島素血癥[1]。由此可見，PCOS的發病機制與胰島素抵抗密切相關。以往研究認為，PCOS卵巢功能障礙的發病機制與外周經典靶組織或器官的胰島素抵抗導致代償性高胰島素血癥對卵巢的作用有關。高胰島素環境下，卵巢間質合成雄激素增多[2]；在卵巢內，胰島素可引起竇前卵泡發育停滯，也可引起顆粒細胞凋亡[10-11]。但近年研究發現，PCOS卵巢也存在胰島素抵抗和糖代謝異常，這可能是導致PCOS卵巢功能障礙的重要機制[4]。近年研究發現，PCOS卵巢胰島素受體數量及其與配體親和力均未發生改變，而胰島素受體底物IRS-1、IRS-2表達和磷酸化異常[12]，提示PCOS卵巢胰島素抵抗是胰島素受體信號結合后缺陷。胰島素受體底物IRS-1優先調節胰島素信號的促有絲分裂途徑，而IRS-2主要調節胰島素的代謝通路[13]。胰島素與受體結合后使受體激活，激活的受體可使IRS-2酪氨酸磷酸化，而磷酸化的IRS-2進一步通過PI3K、Glut4、Ras/MAPK等一系列信號傳導過程實現葡萄糖信號的跨膜轉運。因此，影響胰島素受體反應鏈中的任何一個環節均可導致胰島素抵抗。

Irisin是BOSTROM研究團隊于2012年發現的一種肌源性細胞因子，由骨骼肌分泌，是Ⅲ型纖連蛋白組件包含蛋白5經蛋白水解酶水解后形成的可分泌多肽片段。Irisin幾乎分布于機體所有的組織和器官，如骨骼肌、心臟、大腦、脂肪等[14]。Irisin在骨骼肌合成后迅速釋放入血，誘導具有存儲作用的白色脂肪轉化為具有產熱作用的棕色脂肪，從而增加能量消耗，減輕體質量。隨著研究的不斷深入，學者們逐漸發現，Irisin還可通過內分泌作用參與能量代謝紊亂相關性疾病，如2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心腦血管疾病等[8-9]。有研究證實，Irisin可降低血糖水平，改善胰島素抵抗[5-7]。因此，以胰島素抵抗為重要內分泌改變的PCOS與Irisin的關系成為近年研究的熱點。有研究報道，PCOS患者多伴有Irisin水平改變，并認為Irisin可作為早期診斷PCOS的指標[15]。MASAELI等[16]研究報道，PCOS患者外周血循環Irisin水平與胰島素抵抗相關指標呈正相關關系，并認為Irisin可作為評估PCOS患者胰島素抵抗程度的指標。BOUSMPOULA等[17]研究發現，PCOS患者血清和卵泡液中Irisin水平均高于正常女性。有研究還發現，Irisin能夠促進卵巢顆粒細胞雌二醇分泌[18]，提示Irisin可能對卵巢功能具有一定影響。但其作用機制鮮見報道。

本研究結果發現，PCOS大鼠血清胰島素水平升高，卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α表達降低，證實PCOS除了伴隨全身胰島素抵抗外，也存在卵巢局部胰島素抵抗。本研究還發現，通過Irisin干預，PCOS大鼠血清胰島素水平下降，卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α表達較模型組升高，提示Irisin除了改善PCOS高胰島素血癥外，還可通過增加胰島素受體后信號通路活化，改善卵巢胰島素抵抗。這為探索Irisin對卵巢功能的影響提供了新的方向，同時為PCOS治療提供了新的靶點。本研究Irisin組卵巢組織IRS-2、Glut4、PI3K p85α表達未達到對照組水平，可能與卵巢胰島素信號通路尚未恢復至正常有關。持續給予Irisin腹腔注射能否恢復正常的胰島素信號通路，將是我們今后研究的重點。

綜上所述，Irisin能夠改善PCOS大鼠卵巢胰島素抵抗，其作用機制可能是通過增加卵巢胰島素抵抗相關信號分子IRS-2、Glut4、PI3K p85α表達實現的。但Irisin是通過何種機制引起PCOS卵巢胰島素抵抗相關信號分子表達增加的尚需進一步研究。