miR-133a-3p靶向調控VCP基因對人骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響

鄧仲元，皮聞森，譚小青，賀星，楊樹忠，鄭甦

1 深圳市中西醫結合醫院，廣東深圳518104；2 宜昌市中心人民醫院；3 深圳市寶安區松崗人民醫院

骨肉瘤是兒童和青少年時期最常見的原發性惡性骨腫瘤，具有惡性程度高、侵襲性強、易復發和轉移等特點，預后較差。近年隨著新輔助化療廣泛開展，骨肉瘤患者5年生存率已由單純截肢術時的不足20%提高至60%～70%。盡管化療和手術技術取得了很大進展，但仍有超過30%骨肉瘤患者最終死于該病[1]。目前，骨肉瘤的病因和發病機制尚不完全清楚。近年來，信號傳導通路在骨肉瘤發生、發展中的作用受到諸多學者關注[2-4]。微小RNA(miRNA)是一類長度18～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，在信號傳導通路中扮演重要角色。miRNA通過作用于靶基因3′非翻譯區(3′UTR)，導致靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，從而參與調控靶基因表達。miR-133a-3p是當前研究較多的miRNA家族成員之一。有研究證實，miR-133a-3p能夠參與鼻咽癌、乳腺癌、結腸癌等惡性腫瘤的發生、發展[5-8]。含纈酪肽蛋白(VCP)是一種泛表達蛋白，在多種細胞活動中具有類似分子伴侶的作用。有研究報道，VCP基因在骨肉瘤細胞中過表達，抑制VCP基因表達能夠降低骨肉瘤細胞的侵襲和遷移能力。作者前期通過在線預測軟件和雙熒光素酶報告基因實驗發現，miR-133a-3p可能通過直接調控VCP基因，參與骨肉瘤的惡性進展。2017年7月—2019年7月，本研究觀察了miR-133a-3p靶向調控VCP基因對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞株MG63、U2OS(以下分別稱MG63、U2OS細胞)及人成骨細胞系hFOB1.19(以下稱hFOB1.19細胞)，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。miR-133a-3p mimics、miRNA negative control(以下稱miRNA NC)，購自上海吉瑪制藥技術有限公司。所有引物序列由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。VCP基因相關的雙熒光素酶質粒(野生型WT、突變型MT)，購自美國Invitrogen公司。實時熒光定量PCR儀，購自西安天隆科技有限公司；多功能酶標儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Transwell小室，由美國Promega公司提供。逆轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒及雙熒光素酶活性檢測試劑盒，購自北京艾然生物科技有限公司。

1.2 人骨肉瘤細胞和成骨細胞miR-133a-3p表達檢測 采用RT-qPCR法。取MG63、U2OS細胞和hFOB1.19細胞各1×105個，接種于含15% FBS的DMEM完全培養液，置于細胞培養箱常規培養。待細胞融合70%～80%時，按1∶3傳代。取傳2代、對數生長期、生長狀態良好細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，經鑒定，提取的總RNA濃度、純度和完整性合格，可用于后續實驗。按逆轉錄試劑盒說明，將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。引物序列為：miR-133a-3p上游引物5′-GATTATCCGATGACTCGTAG-3′，下游引物5′-AGTTGACATGATTATGCG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。按照PCR擴增試劑盒說明配制反應體系。PCR反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s共40個循環。收集各樣本閾值循環數(CT)值。以U6為內參，以2-ΔΔCT計算目的基因相對表達量。選取miR-133a-3p相對表達量最低的骨肉瘤細胞進行后續實驗。

1.3 miR-133a-3p過表達骨肉瘤細胞構建與鑒定 按上述方法傳代培養骨肉瘤細胞，將傳2代、對數生長期、生長狀態良好的骨肉瘤細胞接種于96孔板，每孔5×105個。隨機將骨肉瘤細胞分為觀察組和對照組，每組設6個復孔。然后將96孔板置于細胞培養箱中常規培養，定期更換培養液。培養24 h，當細胞生長融合60%～70%時，觀察組與對照組采用Lipofectamine3000瞬時轉染技術，分別轉染miR-133a-3p mimics、miRNA NC。轉染24 h，將無血清培養基更換為完全培養基，繼續轉染24 h。收集細胞，按上述方法檢測miR-133a-3p相對表達量。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。收集兩組上述轉染48 h細胞，胰蛋白酶消化后制成密度為4×104個/mL的細胞懸液，按3×103個/孔接種于96孔板。然后將96孔板置于細胞培養箱中常規培養。分別于培養0、24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育1.5 h。采用多功能酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的光密度(OD)值。以OD450值代表細胞增殖能力。

1.5 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。收集兩組上述轉染48 h細胞，胰蛋白酶消化后制成密度為5×105個/mL的細胞懸液，以500 μL/孔接種于6孔板，孵育至單層細胞鋪滿培養皿底。用200 μL移液器槍頭沿培養皿底部做“一”字形劃痕，鏡下觀察并拍照記錄。棄原培養液，更換為無血清的DMEM培養液，分別于繼續培養24、36 h，鏡下觀察并拍照記錄。根據公式計算細胞遷移率。細胞遷移率=(0 h劃痕寬度-培養后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.6 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室實驗。收集兩組上述轉染48 h細胞，胰蛋白酶消化后制成密度為1×105個/mL的細胞懸液。將Transwell小室底部膜的上表面用基質膠覆膜并孵育過夜。次日，在無血清培養基的Transwell小室上室中加入制備的細胞懸液200 μL，下室加入含10% FBS的DMEM培養液600 μL。然后將Transwell小室置于細胞培養箱中常規培養。培養24 h，取出Transwell小室，輕輕拭去上室面基質膠和未穿膜細胞，經多聚甲醛固定、結晶紫染色，于倒置相差顯微鏡下計數穿膜細胞數。隨機選取10個低倍不重疊視野(100×)進行計數。以穿膜細胞數代表細胞侵襲能力。

1.7 miR-133a-3p靶向調控VCP基因預測 借助生物信息學預測數據庫TargetScanhuman7.2(http：//www.targetscan.org/)，確定miR-133a-3p和VCP的結合位點。

1.8 miR-133a-3p靶向調控VCP基因驗證 采用雙熒光素酶報告基因實驗。根據突變位點分別設計野生型和突變型，以骨肉瘤細胞的cDNA為模板，通過PCR擴增分別獲得野生型和突變型序列，連接到野生型VCP 3′UTR(psi-VCP-WT)和預測位點突變型VCP 3′UTR(psi-VCP-MT)。將骨肉瘤細胞接種于12孔板，隨機分為psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics組、psi-VCP-WT+miRNA NC組、psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics組、psi-VCP-MT+miRNA NC組，于細胞培養箱中常規培養。當細胞生長融合至80%時，psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics組轉染psi-VCP-WT和miR-133a-3p mimics，psi-VCP-WT+miRNA NC組轉染psi-VCP-WT和miRNA NC；psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics組轉染psi-VCP-MT和miR-133a-3p mimics，psi-VCP-MT+miRNA NC組轉染psi-VCP-MT和miRNA NC。轉染48 h，收集細胞，加入細胞裂解液充分裂解，離心留取上清液。按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明檢測各組熒光素酶活性。

1.9 VCP蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集兩組上述轉染48 h細胞，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，加入上樣緩沖液，經沸水浴使蛋白充分變性。取變性蛋白，SDS-PAGE分離蛋白。將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上，分別加入VCP、GAPDH蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育30 min。發光液發光，暗室中曝光、顯影。采用凝膠成像分析系統分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值/內參蛋白電泳條帶灰度值作為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 人骨肉瘤細胞MG63、U2OS和成骨細胞hFOB1.19 miR-133a-3p表達比較 MG63、U2OS細胞和hFOB1.19細胞miR-133a-3p相對表達量分別為0.57±0.17、0.28±0.14、1.09±0.18。MG63、U2OS細胞miR-133a-3p相對表達量均低于hFOB1.19細胞，且U2OS細胞miR-133a-3p相對表達量低于MG63細胞(P均<0.05)。

2.2 兩組轉染效率驗證 觀察組與對照組miR-133a-3p相對表達量分別為4.281±0.204、1.224±0.801，觀察組miR-133a-3p相對表達量明顯高于對照組(P<0.05)。

2.3 兩組轉染不同時間細胞增殖能力比較 見表1。

表1 兩組轉染不同時間細胞增殖能力比較

2.4 兩組轉染不同時間細胞遷移能力比較 見表2。

表2 兩組轉染不同時間細胞遷移能力比較

2.5 兩組細胞侵襲能力比較 觀察組穿膜細胞數為(79.2±10.4)個，對照組為(147.5±9.8)個，觀察組穿膜細胞數明顯低于對照組(P<0.05)。

2.6 miR-133a-3p靶向調控VCP基因預測結果 在TargetScanhuman7.2數據庫中搜索VCP潛在的目標基因，結果發現miR-133a-3p在VCP基因3′UTR 77～83 bp處有且僅有1個保守結合位點。見圖1。

圖1 miR-133a-3p與VCP的結合位點示意圖

2.7 各組熒光素酶活性比較 psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics組熒光素酶活性為0.418±0.042，psi-VCP-WT+miRNA NC組為0.968±0.023，psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics組為0.812±0.054，psi-VCP-MT+miRNA NC組為0.981±0.031。psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics組熒光素酶活性低于其他三組(P均<0.05)，而其他三組熒光素酶活性兩兩比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

2.8 兩組VCP蛋白表達比較 觀察組與對照組VCP蛋白相對表達量分別為1.324±0.023、3.231±0.031，觀察組VCP蛋白相對表達量明顯低于對照組(P<0.05)。

3 討論

骨肉瘤是骨科常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，易發生肺部轉移，預后較差。近年來，隨著手術技術和放化療水平不斷提高，骨肉瘤患者預后得到明顯改善，但其高復發率和高肺部轉移率仍是患者死亡的主要原因[9-12]。目前，骨肉瘤侵襲和轉移的機制尚不清楚。因此，進一步研究骨肉瘤侵襲和轉移的分子調控機制，對尋找骨肉瘤潛在的治療靶點具有重要意義。

信號傳導通路中某些分子的基因經常發生突變，從而使活化的腫瘤干細胞異常增殖。近年來，信號傳導通路在骨肉瘤發生、發展中的作用受到諸多學者關注[2-4]。自2002年CALIN等[13]首次報道miRNA失調與惡性腫瘤有關以來，大量研究證實miRNA失調能夠參與惡性腫瘤的發生、發展。同樣，miRNA失調在骨肉瘤的發生、發展中亦扮演重要角色。miR-133a-3p是當前研究較多的miRNA家族成員之一。有研究報道，上調miR-133a-3p表達能夠明顯抑制急性髓細胞性白血病、胰腺癌和腎癌細胞增殖活性[14-16]。為了證實miR-133a-3p與骨肉瘤的關系，本研究比較了MG63、U2OS細胞和hFOB1.19細胞miR-133a-3p的相對表達量，結果顯示MG63、U2OS細胞miR-133a-3p相對表達量明顯低于hFOB1.19細胞，并且U2OS細胞miR-133a-3p相對表達量低于MG63細胞，故選擇U2OS細胞進行后續實驗。采用瞬時轉染技術轉染U2OS細胞，結果發現，觀察組miR-133a-3p相對表達量明顯高于對照組，表明該技術能夠明顯上調miR-133a-3p表達。進一步研究發現，上調miR-133a-3p表達能夠明顯抑制U2OS細胞增殖、遷移和侵襲能力。證實miR-133a-3p能夠參與骨肉瘤的發生、發展。但其具體作用機制尚不清楚。

VCP是一種泛表達蛋白，在多種細胞活動中具有類似分子伴侶的作用[17]，在內質網相關蛋白降解、核酸重建、細胞周期調控等過程中具有重要作用，具有抑制腫瘤細胞凋亡并促進其增殖、侵襲和遷移等作用[16]。研究表明，在惡性膠質瘤、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、惡性淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病等疾病中VCP基因異常表達，其異常表達與疾病病情進展和患者預后密切相關[18-20]。近年研究發現，VCP基因與骨肉瘤肺部轉移有關，通過RNAi沉默VCP基因能有效抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲[18]。但目前對VCP基因的上游調控機制尚不清楚。本研究運用生物信息學預測數據庫TargetScanhuman7.2確定miR-133a-3p與VCP的結合位點，結果發現miR-133a-3p在VCP基因3′UTR 77～83 bp處有且僅有1個保守結合位點，提示miR-133a-3p與VCP存在靶向關系。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics組熒光素酶活性明顯低于psi-VCP-WT+miRNA NC組、psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics組、psi-VCP-MT+miRNA NC組。而psi-VCP-WT+miRNA NC組、psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics組、psi-VCP-MT+miRNA NC組熒光素酶活性兩兩比較差異均無統計學意義。提示miR-133a-3p是VCP的下游靶分子。進一步研究發現，觀察組VCP蛋白相對表達量低于對照組，提示過表達miR-133a-3p能夠抑制VCP蛋白表達，即miR-133a-3p通過負向調控VCP基因，抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR-133a-3p可能通過負向調控VCP基因，抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。這為探索骨肉瘤侵襲和轉移的分子機制提供了依據，也為骨肉瘤防治提供了新的作用靶點。