鴉膽子素D對非小細胞肺癌細胞生物學行為的影響及其機制

田姍，曹霞，李翔，李曾

西安交通大學醫學院附屬三二〇一醫院，陜西漢中732000

肺癌是臨床常見的呼吸系統惡性腫瘤，全球每年新增病例達180萬例，死亡約160萬例[1]。根據其組織病理學主要分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌兩類，其中85%～90%為NSCLC[2]。大多數NSCLC患者確診時已處于中晚期，錯過了根治性手術的最佳時機，以鉑類為主的化療成為其主要治療手段[3]，但患者預后并不理想，5年生存率不足15%[4-5]。隨著分子細胞水平研究的深入，相繼有靶向藥物問世，為中晚期惡性腫瘤患者帶來了福音。但靶向藥物價格普遍昂貴，超出了普通家庭的支付能力。近年研究發現，許多天然化合物表現出較強的抗腫瘤活性，如小檗堿、姜黃素、鴉膽子素D等[6-8]。鴉膽子素D是從鴉膽子果實中提取的一種水溶性三環四萜類化合物。鴉膽子素D與紫杉醇聯用能夠顯著抑制胰腺癌細胞增殖[9]。鴉膽子素D亦可抑制結腸癌細胞增殖并誘導其凋亡[10]。但目前鴉膽子素D對NSCLC的作用報道較少。2018年12月—2020年5月，本研究探討了鴉膽子素D對NSCLC細胞生物學行為的影響及其機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC細胞系A549、PC9、H1975、H460(以下分別稱A549、PC9、H1975、H460細胞)，購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。鴉膽子素D，純度>98%(HPLC)，規格20毫克/支，購自上海盛中醫藥化工有限公司。將鴉膽子素D用DMSO溶解后配制成1 mmol/L母液分裝，置于-20 ℃冰箱保存備用。Multiskan FC酶標儀，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；FACScan流式細胞儀，購自美國BD公司；Amersham Imager 600凝膠成像系統，購自美國GE公司。細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒，購自江蘇碧云天生物技術有限公司。JNK、p-JNK、β-actin一抗以及辣根過氧化物酶標記的IgG二抗，購自美國Cell Singnaling Technology公司。

1.2 細胞傳代培養 取A549、PC9、H1975、H460細胞，接種于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。當細胞生長融合90%左右時，用含EDTA的0.25%胰酶消化，按1∶4傳代。

1.3 NSCLC細胞和鴉膽子素D濃度篩選 取傳4代、對數生長期、生長狀態良好的NSCLC細胞，用含EDTA的0.25%胰酶消化并計數，以2×103個/孔接種于96孔板，每孔200 μL，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。培養24 h，分別加入100、200、300、400、500 μmol/L鴉膽子素D 10 μL，使鴉膽子素D終濃度分別為5、10、15、20、25 μmol/L，每個濃度設6個平行孔。同時，設置陰性對照組和空白對照組。繼續培養48 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h。棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩混勻，直至結晶充分溶解。酶標儀于570 nm波長處檢測各孔的光密(OD)值，計算細胞存活率和鴉膽子素D的50%抑制濃度(IC50)。細胞存活率=(藥物干預組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。根據IC50選擇對鴉膽子素D敏感度適中的NSCLC細胞和接近IC50時的藥物濃度進行后續實驗。

1.4 細胞周期檢測 采用PI染色法。取上述篩選的NSCLC細胞6×105個，置于6 mL培養液中混勻。取細胞懸液1 mL，接種于6孔板，隨機分為觀察組和對照組，每組設3個平行孔，然后將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養24 h；棄去舊培養液，對照組加入新鮮培養液3 mL，觀察組加入含鴉膽子素D的新鮮培養液3 mL，繼續培養48 h；1 000 r/min離心5 min、離心半徑8 cm，向細胞沉淀中加入冰冷的無水乙醇1 mL，使乙醇的終濃度為70%，4 ℃固定24 h。收集細胞，分別加入含50 mg/mL PI、100 mg/mL RNase A的染色液500 μL，常溫避光染色30 min，上流式細胞儀檢測。采用ModFit LT軟件分析細胞周期中G1、S、G2/M期細胞比例。

1.5 細胞凋亡檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染法。取上述篩選的NSCLC細胞6×105個，置于6 mL培養液中混勻。取細胞懸液1 mL，接種于6孔板，隨機分為觀察組和對照組，每組設3個平行孔，然后將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養24 h；棄去舊培養液，對照組加入新鮮培養液3 mL，觀察組加入含鴉膽子素D的新鮮培養液3 mL，繼續培養48 h；1 000 r/min離心5 min、離心半徑8 cm，收集細胞，加入Annexin V-FITC結合液195 μL重懸細胞，然后分別加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 10 μL，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，上流式細胞儀檢測。

1.6 JNK信號通路蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取上述篩選的NSCLC細胞4×105個，接種至培養皿，隨機分為觀察組和對照組，每組設3個平行培養皿，然后將培養皿置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養24 h；棄去舊培養液，對照組加入新鮮培養液3 mL，觀察組加入含鴉膽子素D的新鮮培養液3 mL，繼續培養48 h。收集兩組細胞，加入細胞裂解液1 mL，提取細胞總蛋白，經BCA法蛋白定量合格。然后加入1×loading buffer緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE分離蛋白(5%濃縮膠、15%分離膠)，采用濕轉法將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入JNK、p-JNK、β-actin一抗(稀釋比均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(稀釋比1∶4 000)，室溫孵育1 h。ECL發光，暗室中曝光、顯影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 NSCLC細胞和鴉膽子素D濃度篩選結果 隨著鴉膽子素D濃度升高，A549、PC9、H1975、H460細胞存活率逐漸降低，呈濃度依賴性(F分別為42.214、36.251、45.014、65.204，P均<0.01)，見表1。鴉膽子素D對A549、PC9、H1975、H460細胞的IC50分別為19.81、18.98、15.51、10.62 μmol/L。A549、PC96、H1975、H460細胞對鴉膽子素D的敏感度依次增強，故選擇敏感度適中的PC9、H1975細胞，以15 μmol/L鴉膽子素D進行后續實驗。

表1 不同濃度鴉膽子素D干預下4種NSCLC細胞存活率變化

2.2 PC9、H1975細胞經鴉膽子素D干預后細胞周期變化 見表2、3。

表2 PC9細胞經鴉膽子素D干預后細胞周期變化

2.3 PC9、H1975細胞經鴉膽子素D干預后細胞凋亡率變化 PC9細胞：觀察組細胞凋亡率為(46.2±5.9)%，對照組為(5.5±1.3)%，觀察組細胞凋亡率明顯高于對照組(t=11.652，P<0.01)。H1975細胞：觀察組細胞凋亡率為(53.2±4.8)%，對照組為(4.5±1.1)%，觀察組細胞凋亡率明顯高于對照組(t=16.861，P<0.01)。

表3 H1975細胞經鴉膽子素D干預后細胞周期變化

2.4 PC9、H1975細胞經鴉膽子素D干預后JNK信號通路蛋白表達變化 PC9細胞：觀察組JNK蛋白相對表達量為0.97±0.08，p-JNK蛋白相對表達量為0.21±0.03，對照組分別為0.96±0.10、0.92±0.14；觀察組p-JNK蛋白相對表達量明顯低于對照組(t=21.352，P<0.01)，兩組JNK蛋白相對表達量比較差異無統計學意義(t=0.032，P>0.05)。H1975細胞：觀察組JNK蛋白相對表達量為0.87±0.04，p-JNK蛋白相對表達量為0.15±0.02，對照組分別為0.89±0.06、0.87±0.09；觀察組p-JNK蛋白相對表達量明顯低于對照組(t=19.254，P<0.01)，兩組JNK蛋白相對表達量比較差異無統計學意義(t=0.962，P>0.05)。

3 討論

目前，臨床對于中晚期NSCLC主要采取以化療為主的綜合治療。常用的化療藥物為細胞毒類，能夠直接殺傷腫瘤細胞，但同時也會損害機體快速增殖的細胞，如免疫細胞、骨髓干細胞，從而抑制機體免疫系統。近年研究發現，許多天然化合物表現出較強的抗腫瘤活性。這些天然化合物配合化療藥物治療惡性腫瘤，不僅能提升化療藥物的抗腫瘤效果，還能減輕其毒副反應，成為近年來研究的熱點。

鴉膽子是苦木科植物鴉膽子的成熟果實。鴉膽子成熟的種子是一種傳統中藥，被收錄于2015版《中國藥典》，用來治療痢疾、瘧疾、雞眼等。梁子寧等[11]研究發現，鴉膽子提取物對口腔念珠菌具有較強的抑制作用。楊丹等[12]研究發現，鴉膽子油乳劑能夠使高脂血癥沙鼠血清膽固醇酰基轉移酶活性顯著增強，心肌和肝臟的脂蛋白脂肪酶活性亦顯著升高，提示鴉膽子油乳劑具有明顯的調脂作用。近年研究發現，鴉膽子還具有一定的抗腫瘤活性[13]。鴉膽子素D是從鴉膽子成熟果實中分離出的一種水溶性三環四萜類化合物，該化合物具有高效的抗胰腺癌、肝癌、結腸癌活性[14-15]。但目前鴉膽子素D對NSCLC的作用報道較少。本研究結果顯示，鴉膽子素D在體外對NSCLC細胞具有一定的抗腫瘤活性，在一定濃度范圍內鴉膽子素D(5～25 μmol/L)對A549、PC9、H1975、H460細胞的抑制作用具有濃度依賴性，并且A549、PC9、H1975、H460細胞對鴉膽子素D的敏感度依次增強。在后續研究中，選擇敏感度適中的PC9、H1975細胞，以15 μmol/L鴉膽子素D進行實驗。

細胞周期特異性藥物主要殺傷處于增殖周期的腫瘤細胞，能夠通過將細胞阻滯于某一時期進而抑制腫瘤細胞增殖。為了探究鴉膽子素D是否具有阻斷細胞周期的作用，我們觀察了15 μmol/L鴉膽子素D對PC9、H1975細胞周期的影響。結果發現，無論是PC9細胞還是H1975細胞，觀察組G1期細胞比例均低于對照組，G2/M期細胞比例均高于對照組，表明鴉膽子素D可阻滯PC9、H1975細胞于G2/M期，延長細胞增殖周期，抑制NSCLC細胞增殖。本研究發現，無論是PC9細胞還是H1975細胞，觀察組細胞凋亡率均高于對照組，表明鴉膽子素D可促進NSCLC細胞凋亡。JNK是絲裂原活化蛋白激酶的主要成員，JNK信號通路在調節細胞存活和細胞凋亡過程中發揮重要作用。BAI等[16]研究發現，蛋白質二硫鍵異構酶家族6可通過調節MAP4K1/JNK信號通路的傳導影響NSCLC細胞的生物學功能。TAN等[17]研究報道，丁氨酸D可通過調節JNK信號通路誘導人NSCLC細胞凋亡。本研究發現，無論是PC9細胞還是H1975細胞，觀察組p-JNK蛋白相對表達量均低于對照組，而兩組JNK蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義，提示鴉膽子素D可能是通過抑制JNK信號通路傳導，阻滯細胞周期并誘導細胞凋亡。

綜上所述，鴉膽子素D可能通過抑制JNK信號通路傳導，抑制NSCLC細胞增殖，阻滯細胞周期進程，誘導細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤作用。