動力學法優化堿性果膠酶比活的測定方法

邢明霞,王鵬博,許文廷,張鳳國,呂興霜,陳相玉,鄔雅喃,詹志春,張永勤,*

(1.青島科技大學化工學院,山東青島 266042;2.武漢新華揚生物股份有限公司,湖北武漢 430070)

果膠存在于植物細胞壁中,是由α-1,4鏈接的D-半乳吡喃糖醛酸單元構成的一種雜多糖,其上含有不同甲酯化度的羧基基團和鼠李半乳糖醛酸聚糖[1-2]。果膠酶廣泛應用于飼料[3-5]、食品[6-10]、醫藥[11-13]、造紙[14-15]、紡織[16-17]等行業。酶活力是果膠酶的關鍵質量控制指標,對于其生產、應用和研發具有重要意義。而酶的比活力(簡稱為比活)為單位質量蛋白質所具有的酶活力,是表示酶的純度高低的一個重要指標。比活力的測定涵蓋蛋白質濃度和酶活力兩個技術指標。

在蛋白質濃度測定方法中,Lowrry法的靈敏度最高,紫外法操作最簡單。工業領域所需測定的果膠酶制劑往往并非純酶制劑,其中所含有的非蛋白物質難免會對測定產生干擾,因此,紫外法很難滿足測定要求,而高靈敏度的Lowrry法是在高倍稀釋度的條件下測定蛋白濃度,盡可能免去了雜質對測定的干擾,因而成為首選測定方法。然而,由于該方法中的牛血清白蛋白(BSA)標準曲線往往不過原點[18],致使果膠酶蛋白濃度在測定中因稀釋倍數不同而不同,由此給測定工作帶來極大困擾。

堿性果膠酶活力的測定方法有粘度法、脫膠作用時間法[19]、滴定法[20-21]、pH比色法[22]、二硝基水楊酸(DNS)比色法[23-24]、甲醇釋放法和紫外法[25]等,其中粘度法和甲醇釋放法已被廢除,目前最常采用的方法為DNS法,但該法仍存在靈敏度較低、果膠降解產物非化學計量等問題[26-29]。對于堿性果膠酶,常使用測定果膠裂解酶活性的紫外法,因裂解發生在堿性條件下,且該法無需顯色反應,產物相對穩定,實驗重復性好。該酶以反式消去方式作用于α-1,4-糖苷鍵,在半乳糖醛酸非還原末端形成C4和C5不飽和鍵,通過測定該不飽和鍵的光吸收即可計算酶活力測定值[25]。在酶活力測定的終點法中,保持酶解進程處于零級反應狀態對于準確測定酶活力至關重要。然而,相關動力學研究迄今未見報道。

因此,本文在建立準確的果膠酶蛋白測定方法的基礎上,擬以動力學測定法從底物、鈣離子激活劑、pH、底物濃度等因素考察堿性果膠酶的酶解進程,并探尋其最優檢測波長,以期確證酶活力測定終點法的合理性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

堿性果膠堿性果膠酶(2.13 kU/mL,QB/T 4482-2013) 武漢新華揚生物股份有限公司;牛血清白蛋白、聚半乳糖醛酸(P3339)、果膠(P9135,甲酯化度為7.7%) Sigma公司;3,5-二硝基水楊酸(DNS)、苯酚、亞硫酸氫鈉、酒石酸鉀鈉、甘氨酸、氫氧化鈉、硫酸鋰、鉬酸鈉、鎢酸鈉、溴水、磷酸、鹽酸、氯化鈣、硫酸銅等 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

pH計(FE20)、AL204電子天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司;HZ-82A恒溫振蕩器 上海易友儀器有限公司;UV2600紫外可見分光光度計 島津儀器有限公司;Vortex 1圓周振蕩器 德國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白濃度的測定 參照張龍翔等[30]的實驗方法來測定酶蛋白濃度。將0.4 mL牛血清白蛋白溶液與Folin甲液2 mL充分混勻,靜置10 min后加入0.2 mL Folin乙液,充分混勻并靜置30 min后測其吸光度值,實驗溫度為室溫(25 ℃)。

1.2.2 酶活力測定方法

1.2.2.1 終點法 取0.1 mL酶液加入2 mL 2 mg/mL聚半乳糖醛酸溶液37 ℃ 酶解15 min后加入3 mL磷酸終止液終止酶解反應,充分混勻,在200～300 nm處測定吸光度值。對照組與實驗組類似,只是0.1 mL酶液在加入3 mL磷酸終止液之后補加。

1.2.2.2 動力學法 取聚半乳糖醛酸溶液20 mL于錐形瓶中,蓋上保鮮膜,放入37 ℃恒溫振蕩器預熱10 min后,加1 mL堿性果膠酶起始酶解反應,分別于20 s、10、20、30、40、50、60 min從錐形瓶中吸取2.1 mL酶解液迅速加入到盛有3 mL磷酸終止液的試管中混勻,以終止酶解反應,在200～300 nm處測定吸光度值。

該酶活力單位可被定義為在最佳酶解條件下,每分鐘使每毫升酶解液的吸光度值增加0.001的酶量為一個酶活單位(U)。

1.2.3 氯化鈣對果膠酶活力測定的影響 在緩沖溶液中加入氯化鈣,配制成含0.44 mmol/L氯化鈣的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液,分別用含氯化鈣緩沖溶液和不含氯化鈣緩沖溶液配制2 mg/mL聚半乳糖醛酸溶液和梯度酶溶液酶溶液(0～4.36 μg/mL),參照1.2.2.1的方法進行測定。

1.2.4 底物對酶活力測定的影響 用pH9 0.2 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液配制梯度酶溶液(0～4.36 μg/mL),用緩沖溶液分別配制2 mg/mL聚半乳糖醛酸和2 mg/mL果膠溶液作為底物溶液,參照1.2.2.1的方法進行測定。

1.2.5 pH對酶活力測定的影響 各取pH(7.5、8、8.5、8.8、9、9.2、9.5、10)的2 mg/mL聚半乳糖醛酸溶液20 mL于錐形瓶中,蓋上保鮮膜,放入37 ℃恒溫振蕩器預熱一段時間。參照1.2.2.2的方法進行測定。

1.2.6 底物質量濃度對酶活力測定的影響 各取濃度不同的聚半乳糖醛酸溶液(0、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.7、1、2、3 mg/mL)20 mL于錐形瓶中,蓋上保鮮膜,放入37 ℃恒溫振蕩器預熱一段時間,加1 mL 0.436 μg/mL堿性果膠酶起始酶解反應,參照1.2.2.2的方法進行測定。

1.2.7 酶質量濃度對酶活力測定的影響 取2 mg/mL聚半乳糖醛酸溶液溶液20 mL于錐形瓶中,蓋上保鮮膜,放入37 ℃恒溫振蕩器預熱一段時間。加1 mL梯度稀釋的堿性果膠酶液(0～1.43 μg/mL)起始酶解反應,混合后酶解液中酶濃度為0～0.071 μg/mL,參照1.2.2.2的方法進行測定。

1.2.8 檢測限(LOD)的測定 用最適pH配制的緩沖溶液代替果膠酶液,參照1.2.2.1的方法進行測定。其中,LOD的計算公式如下:

LOD=t(n-1,0.99)×S/Slope

式(1)

式中,S為酶濃度為0的0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液根據1.2.2的方法所測得的空白值的標準偏差,樣本數(n)為10;Slope為酶解30 min所測得的酶解產物的吸光度值;t(n-1,0.99)=2.821。

1.2.9 DNS法測定果膠酶活力

1.2.9.1 還原糖的測定及標準曲線的繪制 分別取具有一定濃度梯度(0～1 mg/mL)的半乳糖醛酸溶液0.4 mL于試管中,加入0.3 mL DNS試劑[30],混勻,在沸水浴中加熱10 min,立即用冷水冷卻至室溫,加4.3 mL水,混勻,在490 nm處測吸光度值,根據每組半乳糖醛酸濃度與反應后不同時間測得的半乳糖醛酸吸光度值之間的關系繪制標準對應關系曲線。

1.2.9.2 酶活力測定法及DNS法酶活力單位定義 取4 mL 7 mg/mL的果膠于錐形瓶,放入37 ℃恒溫振蕩器預熱一段時間預熱,加入4 mL 0.349 μg/mL果膠酶液迅速混勻以起始酶解反應,分別于20 s、10、20、30、40、50、60 min從錐形瓶中吸取0.4 mL酶解液,迅速加入到盛有0.3 mL DNS的試管中混勻,以終止酶解反應,參照1.2.9.1的方法進行還原糖測定,以20 s時的酶解液為空白,根據半乳糖醛酸標準曲線的回歸方程計算每個時間段內還原糖的增加量。果膠酶的活力單位可被定義為在上述條件下,每毫升反應液中,每分鐘產生1 μmol/mL相當于半乳糖醛酸的量為一個酶活力單位。

1.3 數據處理

采用Excel 2016進行圖表及數據處理,并計算每個波長下的斜率(Slope)、線性決定系數(R2)和截距(Intercept)、檢測限(LOD)、相對標準偏差(RSD)以及空白的標準偏差(S)的計算。

2 結果與分析

2.1 蛋白濃度測定方法優化與果膠酶蛋白濃度的測定

本文采用靈敏度較高的Lowrry法測蛋白濃度,為了探求最佳顯色波長,以不同濃度的牛血清白蛋白(BSA)繪制標準曲線,并以相同的方法測定果膠酶蛋白濃度,待顯色后在450～700 nm波長范圍下進行光譜掃描以獲得該波長下吸光度值,計算每一波長下標準曲線的斜率、截距和R2,并對波長作圖,結果如圖1所示。標準曲線的斜率隨波長增大而增大的同時,其空白值也隨之增大(如圖1a)。當波長大于550 nm時,如常規采用的檢測波長為750 nm[18]、640 nm[31]等,則導致其線性決定系數R2隨之下降,截距明顯增加,如圖1b所示,果膠酶蛋白的濃度回歸曲線與BSA的結果相似。因此,為避開空白值對測定的干擾,550 nm是最佳測定波長,其R2最大,截距最小。該波長下測得BSA蛋白濃度曲線如圖1c所示,為避免稀釋倍數不同而導致的測定值差異,特將BSA標準曲線和果膠酶蛋白濃度回歸曲線逼過原點,則其線性方程分別為y=0.5223x(R2=0.9978)、y=0.1198x(R2=0.9955),將果膠酶蛋白所測吸光度值帶入前者公式中即可獲得果膠酶蛋白濃度測定值,并根據稀釋倍數換算得果膠酶蛋白原液的濃度為4.36 mg/mL。

圖1 檢測波長對蛋白質標準曲線及果膠酶蛋白測定的影響

2.2 氯化鈣對酶測定的影響

鈣離子有利于促進果膠酶發揮裂解作用,對果膠酶有激活作用[32],因此有必要考察其對酶活力測定的影響。圖2為酶蛋白濃度在0～4.36 μg/mL時酶解30 min的酶蛋白濃度回歸曲線,其中氯化鈣濃度為0.44 mmol/L。結果表明,鈣離子可提高酶解活力至2倍以上,且其酶濃度回歸曲線的截距更接近原點,更有利于果膠酶活力的測定與計算。

圖2 氯化鈣對果膠酶活力測定的影響

2.3 底物對酶活力測定的影響

酶活力測定成本絕大部分取決于果膠酶解底物,因此,選擇專一性底物并在較低濃度下進行酶活力測定是降低檢測成本的重要手段之一。本實驗分別以果膠和果膠的主鏈結構聚半乳糖醛酸為底物,考察在上述優化條件下,該果膠酶在不同蛋白濃度(0～4.36 μg/mL)條件下的酶活力,其中,底物濃度為2 mg/mL,pH為9。結果表明,以聚半乳糖醛酸為底物可獲得更高酶活力,是以果膠底物的1.62倍,如圖3所示。可能原因為果膠酶優先對甲酯含量低的果膠酸作用,實驗中果膠甲酯含量較高,導致酶的分解速率降低。

圖3 底物對果膠酶活力測定的影響

2.4 pH對酶活力測定的影響

在最適pH條件下測定其活力,才能體現酶制劑的最大價值。因此利用不同pH(7.5、8、8.5、8.8、9、9.2、9.5、10)的0.2 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液配制成2 mg/mL的聚半乳糖醛酸溶液,并根據1.2.2.2的方法,通過動力學酶解進程曲線以優化酶解pH。其中,果膠酶蛋白濃度為0.436 μg/mL,即,將原酶液稀釋十萬倍。結果表明,在200～300 nm 波長范圍內,在pH9.5時顯示最大酶解速率(即單位時間內產物的生成速率),如圖4a所示,該結果在圖4b中,在232 nm波長下不同pH條件下的酶解速率比較中得以進一步證實。在pH9.5,檢測波長為232 nm條件下,各酶蛋白濃度的酶解進程曲線均顯示為零級反應,如圖4c所示。這說明在pH9.5條件下的以終點法測定酶活力是切實可行的。

圖4 pH對果膠酶活力測定的影響

圖5 底物質量濃度對果膠酶活力測定的影響

2.5 底物質量濃度對酶活力測定的影響

圖5為按照方法1.2.2所做的不同底物質量濃度(初始濃度為0～3 mg/mL)條件下的酶解進程曲線,其中酶濃度為0.436 μg/mL。由該圖5可看出,底物濃度在低于1 mg/mL時對酶解速率影響明顯;在2 mg/mL時達到最大值,酶解產物隨時間呈線性增長,即處于零級反應狀態;在3 mg/mL時,酶解速率已開始下降,可能的原因是,較高黏度會減小傳質速率,影響酶促反應進程,因此2 mg/mL作為測定酶活力時的最佳底物質量濃度(初始濃度)。此外,由動力學曲線可知,在較低底物質量濃度(≤0.7 mg/mL)條件下,其反應進程均非零級反應,即便通過酶解10 min的產物濃度(吸光度值)也無法得到準確的Km值,顯然,標準物質對于Km值的測定至關重要,僅用系數校正可能不能滿足Km值測定的要求。

2.6 酶濃度對酶活力測定的影響

在上述優化的酶活力測定條件下,按照1.2.2.2的動力學法考查酶質量濃度對酶解進程的影響。如圖6a所示為不同酶終濃度范圍下,檢測波長對酶解速率的影響,由圖6a可知在232 nm波長下得到最大酶解速率;由圖6b可知,在220～245 nm波長區域下,酶解速率與酶質量濃度具有良好線性關系,以酶解30 min為例,其LOD值在232～240 nm也保持較低水平;然而,檢測波長越大,其相對標準偏差(RSD值)會隨之增大,說明精密度會隨之降低(圖6c)。因此,綜合檢測靈敏度及精密度的結果,232 nm為最佳檢測波長。

圖6 檢測波長對果膠酶活力測定的影響

在該檢測波長下,所測得的各酶濃度條件下的酶解動力學進程曲線均顯示零級反應狀態,如圖7a所示,且酶質量濃度與酶解速率呈良好線性(圖7b),其R2達0.9967,更為重要的是該曲線過原點,避免了果膠酶制劑因稀釋倍數不同產生的測量誤差,而不過原點的問題在DNS法中普遍存在[23-24]。由酶動力學曲線的零級反應狀態可知,終點法測酶活力時,吸光度值只要在0～2范圍內,酶解時間可以靈活掌握,而非拘泥于一個固定的時間段。以終點法酶解30 min為例,LOD值為0.0071 μg/mL,將該值帶入圖7b中的公式“y=0.0213x”,則LOD為0.15 mU/mL,本文所用堿性果膠酶制劑的比活可通過圖7b中的公式“y=0.6398x”計算并得出21.3 U/mg蛋白,該酶制劑蛋白含量已在2.1中求得為4.36 mg/mL,因此,該產品的酶活力為0.92 kU/mL。

圖7 果膠酶濃度動力學曲線

2.7 DNS法測堿性果膠酶活力

根據圖8可以看出,DNS靈敏度很低,當半乳糖醛酸濃度很低時難以檢測到,所以DNS測半乳糖醛酸標準曲線是不過原點的,所以利用DNS法測標準曲線計算酶活力會出現較大的偏差。根據右圖可以看出,DNS法測酶活力時,隨著酶解時間的增加,反應不是零級反應,所以酶解時間會影響比活的測定,所以在利用終點法測酶活力時,酶解時間不能靈活掌握,限制了酶活力測定。以終點法酶解30 min為例,計算并得出647 U/mg蛋白,該產品的酶活力為2.82 kU/mL。但是利用DNS測酶活力,在測定過程中,酶解速率隨酶解時間的增加不是呈直線增加,所以測定結果存在不準確性。

圖8 DNS法測果膠酶活力曲線

3 結論

本文利用Folin-酚法來測果膠酶蛋白濃度,牛血清白蛋白和酶蛋白在450～700 nm下測定標準曲線來優化果膠酶測定波長為550 nm,在此波長下計算得到酶蛋白為4.36 mg/mL;實驗驗證鈣離子可以作為果膠酶的激活劑,可以提高酶解活力;以果膠為底物的條件下酶解速率遠遠小于以聚半乳糖醛酸為底物的酶解速率;實驗利用動力學法在最優測定條件下所測得果膠酶蛋白質量濃度與酶解速率酶質量酶解進程曲線,在其吸光度值0～2范圍內均處于零級反應狀態。通過動力學優化酶的最佳pH為9.5,優化底物濃度為2 mg/mL,最佳測定波長為232 nm,在此波長下通過酶解動力學,根據各酶濃度酶解速率的線性回歸方程得到LOD為0.15 mU,比活為21.3 U/mg蛋白,得到該產品的酶活力為0.92 kU/mL。通過酶動力學曲線的零級反應狀態可知,在利用終點法測酶活力時,吸光度值只要在0～2范圍內,酶解時間可以靈活掌握,而非拘泥于一個固定的時間段。本文還與DNS法進行對比,突出本實驗方法的準確性和靈活性。