低壓靜電場處理對帶魚微凍貯藏期間品質變化影響

張家瑋,謝 超,*,余 銘,張海玲

(1.浙江海洋大學食品與醫藥學院,浙江舟山 316022;2.浙江馳力科技股份有限公司,浙江舟山 316022;3.舟山富晟食品科技有限公司,浙江舟山 316022)

帶魚(Trichiuruslepturus)又名鞭魚、裙帶魚、刀魚、白邊魚[1],其腥少味美,深受消費者的喜愛。浙江舟山位處東海,盛產帶魚。與其他品種帶魚相比,舟山帶魚骨小肉厚,氨基酸種類多,脂肪、二十二碳六烯酸含量高,脂肪層中富含微量元素[2]。帶魚脂肪比例為4.76%,遠高于黃魚、鯧魚等海產魚類,脂肪氧化后生成的醛、酮類物質對其品質影響很大[3]。由于帶魚出水即死,其保鮮手段十分有限,通常以冷海水碎冰覆蓋方式運輸銷售,但魚體中心未能達到凍結點會滋生腐敗菌;-18 ℃下冷凍雖能長時間保持其品質,但長期低溫會引起肌動蛋白和肌球蛋白變性,破壞組織結構,使肉質變軟、口感變差。

物料凍結點下1～2 ℃左右即為微凍保鮮溫度,此溫度下能魚體內自由水和不易流動水凍結形成低溫保護層,減少溫度波動引起的生物[4]、物理[5]、化學反應[6]對魚體影響。其中,胡玥等[7]研究了三種保藏方式對帶魚品質影響,發現10 d內微凍貯藏和-18 ℃貯藏保鮮效果基本一致。微凍保鮮有諸多優勢,但民用制冷裝置均存在不同程度溫度波動,擴大了魚體表面和中心的溫度差,造成冰晶大小不一,繼而破壞魚體肌肉組織,最終造成解凍后魚體細胞吸水不充分,肌肉組織無法正常復原導致變質。

低壓靜電場技術(Low voltage electrostatic field,LVEF)是通過靜電板產生靜電場再經變壓器升壓產生直流電壓,正負電子通過影響細胞原生質膜的跨膜電位和酶活性[8],其能延緩果蔬、肉品、水產品品質劣變。其中,He等[9]分別用6、8、10 kV的電場處理豬肉,分別測其解凍時間縮短了12、18、24 min,微生物總數減少了0.5～1 lg(CFU/g);Miller等[10]發現施加高壓靜電場能有效加快冷凍金槍魚塊的解凍速率,抑制二甲胺、三甲胺生成,同時將解凍速率增大到對照組樣品的1.78倍,但后續測得高壓電場會使蛋白質溶解度異常,對樣品硬度、粘性、粘結性和咀嚼性也有一定影響。高壓靜電技術釋放電壓強度大,危險性高,使用范圍有限,無法大規模應用;低壓靜電場技術基于低壓靜電場發生裝置“鮮霸”進行,搭配三塊低壓放電板持續分壓保鮮,此法既可緩釋帶魚凍結時的大冰晶生成,又顯著提升其安全性。如路立立[11]采用阻隔性氣調包裝低壓靜電場聯合保鮮手段,發現此法能降低豬肉凍藏時流失汁液的氨基酸含量,有效縮短解凍時間提高豬肉嫩度和貯藏時間。-18 ℃下低壓靜電場放電板與樣品隔距為30 cm處牛肉組織冰晶較小且分布均勻,液體流失率、蒸煮損失率分別降低4.18%與8.28%[12]。現對微凍保鮮和高壓靜電場研究很多,但微凍貯藏與低壓靜電場聯合進行水產品保鮮技術研究未見報道。

本文以新鮮舟山帶魚為主要原料,通過對-4 ℃的微凍低溫環境下分別進行pH、總揮發性鹽基總氮(Total Volatile Basic Nitrogen,TVB-N)、硫代巴比妥酸值(Thiobarbituric Acid,TBA)、菌落總數(Total Viable Counts,TVC)、K值、蘇木精-伊紅(Hematoxylin&Eosin,H&E)染色分析、掃描電鏡(Scanning Electron Microscope,SEM)分析等,綜合評價低壓靜電場技術對帶魚微凍貯藏過程中品質變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮帶魚 長約0.8 m,厚約2.4 cm,眼球飽滿、體表銀白、無肉眼可見破損,舟山正品科技公司;乙醇、磷酸、高氯酸、硫代巴比妥酸、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氧化鎂、硼酸、鹽酸、高氯酸、腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、肌苷酸、次黃嘌呤核苷、次黃嘌呤、腺苷酸 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;三氯乙酸 優級純,上海麥克林生化科技有限公司;磷酸緩沖液 pH7.2～7.4,北京索萊寶科技有限公司;4%多聚甲醛 生工生物工程(上海)股份科技有限公司;2.5%戊二醛 優級純,福州飛凈生物科技有限公司;切片石蠟 衛永實驗器材有限公司。

HD207溫度記錄儀 意大利Deltaohm公司;FB-110Q均質機 上海勵圖公司;分析天平 Mettler Toledo公司;T10高精度數顯勻漿機 IKA公司;Agilent 1260 Infinity液相色譜儀 美國安捷倫公司;Microfuge 16高速冷凍離心機 美國貝克曼公司;U-5200紫外可見分光光度計 日本日立公司;FS400D高速攪拌機 日本EYELA公司;JZK-260T臺式真空包裝機 蘇州嘉邁公司;SHZ-85F水浴恒溫振蕩器 上海喆圖科學儀器有限公司;HZQ-F160全溫振蕩培養箱 常州申光儀器有限公司;Aperio AT2高通量快速切片掃描儀 上海萊卡貿易公司;PB-10酸度計 賽多利斯公司;FCD268SEA冰箱 海爾集團有限公司;TM-1000臺式掃描電子顯微鏡 日本日立公司;Protocol3自動菌落分析儀 英國Synbiosis公司;SE&BA3000V 50Hz鮮霸電場裝置 浙江馳力科技公司;低壓靜電放電板 浙江馳力科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理與分組 將新鮮帶魚去除頭和內臟,用純水洗凈后裝袋真空包裝,置于-4 ℃普通冰箱和電場冰箱保鮮待用,分別在第0、3、6、10、15、21、28 d采樣,測定其理化指標。

低壓靜電場發生裝置由一臺SE&BA鮮霸主機和三塊低壓靜電放電板組成,整套電場設備安裝在冰箱內部后通電即可產生低壓靜電環境,實驗組樣品均貯藏于電場環境,裝置如圖1所示。

圖1 低壓靜電場裝置與低壓靜電放電板

對照組(CK):未做任何處理,在-4 ℃微凍條件下貯藏帶魚;

實驗組(LVEF):參考王杏娣等[13]方法將3000 V、50 Hz電場設為實驗條件,處理后在-4 ℃微凍條件下貯藏帶魚。

1.2.2 冷卻曲線的測定 參考Smykov等[14]方法稍作修改。將帶魚洗干凈取出內臟和雜質后,用小刀在魚背肌肉大群處切出3 cm×3 cm×2 cm的小口放入-18 ℃冰柜進行凍結,隨后設定自動溫度記錄儀時序,將熱偶探頭插入小口處,每隔2 min記錄一次溫度,直到樣品中心溫度降至-18 ℃結束測定,繪制冷卻曲線。

1.2.3 pH的測定 取5 g帶魚肉攪碎后置于15 mL離心管中,加入10 mL超純水,均質樣品1 min測定樣品pH。

1.2.4 TVB-N的測定 參考GB 5009.228-2016[15]中自動凱氏定氮儀法進行測定,平行測定3次,結果以mg/100 g表示。

1.2.5 TBA的測定 參考GB 5009.181-2016[16]的方法稍作修改。取帶魚背部肌肉5 g研磨攪碎后準確加入50 mL三氯乙酸混合液于100 mL具塞錐形瓶中,搖勻,檢查其氣密性后于恒溫振蕩器振搖30 min,待其冷卻后做雙重過濾,取第二次濾液上清液5 mL加入5 mL0.02 mol/L TBA水溶液,90 ℃水浴加熱40 min后冷卻1 h,在532 nm處測其吸光值。

式(1)

式中:X:TBA值(mg/100 g),c:式樣丙二醛濃度(μg/mL),V:樣品溶液定容體積(mL),m:帶魚質量(g),10:換算系數。

1.2.6 TVC的測定 參考GB 4789.2-2016[17]的方法進行測定,結果以lg(CFU/g)表示。

1.2.7 K值的測定 參考SC/T3048-2014[18]中高效液相色譜法稍作修改進行測定。20 ℃下取帶魚背部肌肉,4 ℃下均質,將10%高氯酸溶液20 mL與2 g帶魚肌肉樣品混勻,20 ℃下將樣品振蕩60 s后高速冷凍離心10 min,再用10 mL高氯酸溶液提取合并物,離心10 min,用3.8%～38% NaOH溶液將pH調至6.0～6.4范圍內,將樣品定容至50 mL,離心10 min,微孔濾膜過濾,待測。色譜條件:C18色譜柱;流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;波長:254 nm;進樣量:20 μL。

計算公式:K值=(MHxR+MHx)/(MATP+MADP+MAMP+MIMP+MHxR+MHx)×100

式(2)

式中:MATP:腺苷三磷酸含量,MADP:腺苷二磷酸含量,MAMP:腺苷酸含量,MIMP:肌苷酸含量,MHxR:次黃嘌呤核苷含量,MHx:次黃嘌呤含量,單位均為μmol/g。

1.2.8 H&E染色 20 ℃下取出帶魚,用剪刀沿脊線小心劃開帶魚背部肌肉,取樣刀取8 mm×8 mm×4 mm肌肉組織薄片,立刻放入4%多聚甲醛中固定,室溫下固定1 d后用pH7.2～7.4的磷酸緩沖液沖洗3次,每次5 min,做由低到高梯度乙醇脫水,二甲苯透明樣品,待樣品透明做浸臘包埋,切片染色進行分析掃描。

1.2.9 掃描電鏡觀察 20 ℃下取出帶魚,剔骨剝皮,切成4 mm×4 mm×15 mm的立方體長條迅速放入2.5%戊二醛固定液中,4 ℃下固定4 h,用pH7.2的磷酸鹽緩沖液沖洗3次,每次10 min,再次沖洗后分別用30%～100%濃度乙醇脫水,置入干燥器中干燥12 h,噴金粘樣掃描。

1.3 數據處理

采用GraphPad Prism 8進行數據處理,采用Origin 2018 64Bit對數據作圖,所有樣品進行3次平行實驗。

2 結果與分析

2.1 冷卻曲線分析

現有對水產類冰點測定方法主要有差示掃描量熱法(Differential Scanning Calorimetry,DSC)和冷卻曲線法[19]。相比DSC法測定冰點,冷卻曲線法測定水產品過程更為簡易,且此法要求的冰點測定范圍較小,結果更為精準。圖2為帶魚的冷卻曲線。可以看出帶魚在前處理后初始溫度為10 ℃,隨時間變化其中心溫度迅速地下降,在24 min時降至0 ℃,40 min時達到過冷點并釋放熱量,4 min后溫度上升,直到120 min時溫度仍處于相對穩定狀態。通常將過冷點后出現的升溫點設為冰點[19],自動溫度記錄儀顯示此點溫度為-2.5 ℃即為冰點。因微凍貯藏溫度需低于物料冰點1～2 ℃,將-4 ℃設為貯藏溫度對帶魚進行保鮮貯藏。

圖2 帶魚冷卻曲線

2.2 pH變化

圖3展示了28 d內不同貯藏條件下實驗組(LVEF)和對照組(CK)pH變化情況,曲線均呈現先降后升趨勢。帶魚第0 d時pH為7.08,第3、6 d有不同程度下降。貯藏初期pH降低是因為帶魚出水即死,隨后進入死后僵硬狀態,糖原和ATP分解產酸使pH下降。6 d后pH開始回升,對照組21 d時pH達到7.21超過初始pH,并于28 d升至7.48;實驗組15 d時曲線回升速率開始下降,28 d時pH為7.33,略低于對照組。6 d后因為水解酶和微生物的作用蛋白質分解為氨基酸與堿性物質,所以魚體會由酸性再向中性轉變,故表現為上升趨勢[20]。電場處理后帶魚pH波動范圍維持在±0.33之內,造成這種差異的原因可能是電場能通過改變細胞膜跨膜電位差來降低微生物活性和水解酶活性,進而減少堿性物質過量產出,使pH維持在初始水平附近,從而保持魚體新鮮度[21]。pH越高則魚肉腐敗程度越高,因此在水產品貯藏時要注意控制pH的變化,這與李來好等[20]觀點相同。

圖3 低壓靜電場處理對帶魚微凍貯藏過程中pH變化影響

2.3 TVB-N值變化

根據SC/T 3102-2010[22]規定帶魚一級品TVB-N≤13 mg/100 g,合格品TVB-N≤30 mg/100 g,鮮購帶魚0 d時TVB-N為9.31 mg/100 g,均為一級品。由圖4可看出在28 d貯藏期內兩條TVB-N曲線均呈上升趨勢,對照組上升更快。在0～6 d內實驗組和對照組TVB-N增長速度較快,分別增長了6.44、12.69 mg/100 g,實驗組增速更緩慢。這可能是因為貯藏初期帶魚中心溫度不夠低,高頻率的溫度波動和微生物活動加劇了帶魚蛋白質脫氨基作用致使TVB-N迅速上升[23]。6～21 d兩組均呈緩慢上升趨勢,21 d時對照組TVB-N達到29.81 mg/100 g,已接近不可食狀態,28 d時實驗組TVB-N為23.24 mg/100 g仍未超出合格品限定閾值,且遠低于同時期對照組33.24 mg/100 g。這表明-4 ℃時LVEF能抑制帶魚體內微生物活性和組織蛋白酶活性,減少微生物和酶對蛋氨酸、酪氨酸等氨基酸的分解作用[24]。與對照組相比實驗組貨架期延長了7 d以上,提高了保鮮效果。

圖4 低壓靜電場處理對帶魚微凍貯藏過程中TVB-N變化影響

2.4 TBA值變化

帶魚屬中脂魚,魚油含有大量二十二碳六烯酸,這類不飽和脂肪酸極易與O2發生氧化反應產生丙二醛,丙二醛對蛋白質等大分子產生交聯聚合破壞帶魚品質[25],硫代巴比妥酸(TBA)可與丙二醛成色,代表帶魚在貯藏時的氧化程度。如圖5所示兩組樣品TBA均呈增速增長。新鮮帶魚TBA為0.38 mg/100 g,6 d時兩組TBA差值為0.11 mg/100 g,曲線增長平緩,隨貯藏時間延長TBA差值逐漸增大,28 d時對照組TBA達到1.78 mg/100 g,實驗組僅為1.30 mg/100 g,與21 d對照組TBA相當。貯藏后期樣品中心溫度降低,大體積的冰晶加劇會細胞破損,而低壓靜電場產生的電荷能形成電荷隔絕層,進而縮小空氣中氧氣和帶魚不飽和脂肪酸的接觸范圍,脂肪的氧化酸敗也得到了抑制[26]。因此LVEF在-4 ℃微凍條件下能延緩帶魚脂肪氧化,將貨架期延長了7 d以上。

圖5 低壓靜電場處理對帶魚微凍貯藏過程中TBA值變化影響

2.5 TVC值變化

圖6 低壓靜電場處理對帶魚微凍貯藏過程中TVC值變化影響

2.6 K值變化

K值已被用作評價魚類新鮮度的最有效指標。一般來說,水產品K值小于20%就達到了“生魚片”生產標準的極為新鮮狀態,20%～60%被認為在可接受范圍內,60%～80%魚體出現輕微腐敗,80%以上則為重度腐敗不可食用[31]。由圖7可知,兩組樣品K值曲線隨貯藏時間變化均呈上升趨勢,且對照組上升更快。帶魚初始K值為13.28%,已經處于一個較高水平,這是由于帶魚生活在高壓海域,捕撈上岸立刻死亡,魚體僵直時三磷酸腺苷會迅速分解,提高了K值水平[32]。對照組10 d時K值為68.17%,出現輕微腐敗現象,10～21 d時增長速度減緩,貯藏結束時達到88.71%,已呈重度腐敗狀態。實驗組K值增速較慢,貯藏至21 d其K值仍未超過可接受范圍,28 d時為63.17%,也出現了輕微腐敗跡象。0～28 d實驗組始終低于對照組,說明低壓靜電場在-4 ℃微凍貯藏條件下可以通過影響內源酶活性改變三磷酸腺苷的降解速率,從而減緩帶魚腐敗變質速率,起到良好的保鮮作用。

圖7 低壓靜電場處理對帶魚微凍貯藏過程中K值變化影響

圖8 帶魚背部肌肉橫向切面圖

2.7 H&E染色分析

圖8分別展示了實驗組和對照組0、3、10、21、28 d時經H&E染色后的橫向剖面圖。較低溫度時微生物、酶以及機械物理損傷均有不同程度影響,但對肌肉組織結構最具破壞力的是低溫水形成的冰晶,高密度的大冰晶會引起水產品蛋白質變性及嚴重的汁液流失,造成不可逆破壞[5]。新鮮帶魚圖8(a)中,可見帶魚肌纖維線條連接緊密無縫隙,排列整齊規律。3 d后對照組圖8(b)由小直徑纖維到大直徑纖維的纖維間隙逐漸增大且肌間有細小冰晶生成;實驗組圖8(c)與新鮮樣相比出現微小肌肉裂痕,未見明顯冰晶。10～21 d期間,對照組圖8(d)、圖8(f)肌肉纖維內部出現因冰晶粒徑膨脹帶來的斷裂,結構破壞較明顯;實驗組圖8(e)、圖8(g)部分肌纖維被擠壓變形,纖維束密度下降直徑變小,細胞開始出現水分流失但肌原纖維排列整齊,未見明顯斷裂。28 d時,相較實驗組圖8(i),對照組圖8(h)細胞內出現大量大冰晶和孔洞,肌肉組織內部斷開撕裂現象嚴重,大冰晶擠壓纖維束致使纖維束扭曲變形和細胞結構變位,整個肌肉組織失去了完整結構。冰晶越小對水產品品質帶來的破壞就越低[33]。低壓靜電場可以通過改變物料結冰點,降低大冰晶凝聚速率,減小冰晶粒徑,增加冰晶數目使冰粒均勻分布,小冰粒會保護細胞在低溫微凍貯藏時的完整性,阻止肌球蛋白和肌動蛋白變性[3],達到解凍后保留帶魚最佳品質的目的。

2.8 微觀組織結構變化

為更好驗證電場對微凍貯藏過程中帶魚影響,在H&E染色分析的基礎上需要放大倍數更高掃描電鏡進行微觀結構分析。新鮮帶魚圖9(a)在10 μm范圍觀察肌原纖維大小均勻,纖維束細密無間隙,細胞結構完整。3 d時對照組圖9(b)和實驗組圖9(c)對比尚不明顯,對照組出現少量肌原纖維與網狀組織組成的冰晶形態物質,這與H&E染色分析結果類似。15 d時對照組圖9(d)和實驗組圖9(e)有了較為明顯的差異,對照組出現了粗絲斷口且斷口有很多拔出狀纖維,黑色區域的增多也代表纖維空隙和冰晶尺寸逐漸增大;實驗組50 μm范圍觀察實驗組肌原纖維排列整齊,絮狀物質與細絲有粘連現象,原生質膜清晰,整體變化較小。28 d時處于100 μm范圍觀察對照組圖9(f)整體肌肉組織內部微觀結構破壞程度加劇,肌原纖維嚴重扭曲變形,纖維束分解,細胞骨架形狀紊亂錯位;反觀實驗組圖9(g)出現了肌肉組織雖有合并粘連現象,但未發生內部結構破損,兩者形成顯著差異。可以說經過低壓靜電場的處理,低溫對帶魚肌肉組織微觀結構與帶來的不良影響被大幅削弱,此結果驗證了H&E染色實驗分析,與菌落總數等其他理化指標結論一致。

圖9 帶魚肌肉組織的掃描電鏡圖

3 結論

以舟山帶魚為研究對象,評價低壓靜電場技術對帶魚微凍貯藏過程中品質變化的影響。結果表明新鮮帶魚經過電場-微凍處理后有了更好的保鮮效果,貯藏至28 d,對照組TVB-N值為33.24 mg/100 g,已呈不可食狀態,pH波動較大,菌落總數為6.43 lg(CFU/g),TBA值達到1.78 mg/100 g,脂肪氧化嚴重,肌肉分離斷裂現象嚴重,K值高達88.71%,整體品質下滑嚴重;實驗組整個貯藏期TVB-N、菌落總數、TBA等理化指標均優于對照組,28 d時K值為63.17%,遠低于對照組,pH波動范圍較小,SEM分析其肌肉纖維縫隙少無明顯裂痕,肌原纖維內部結構完整,新鮮度高,貨架期提升了7 d以上。這說明低溫貯藏時放置3000 V低壓靜電場發生裝置能抑制微生物與酶的活性,延緩帶魚貯藏過程中的品質變化,解凍后帶魚品質得到了提高,為冷凍水產品品質研究提供了新方法。