不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的影響

姚紅麗 姚英武 崔開宇 仝進毅 孫麗萍

菟絲子為抗腫瘤復方藥的主要成分，既往研究已經證實在菟絲子乙醇提取物的單體成分中可以通過直接或間接的方式起到免疫調節、抗氧化等作用[1-2]。目前有關中藥單體對宮頸癌Hela細胞抑制的研究較多[3-4]，但是有關菟絲子乙醇提取物的研究相對較少。本研究旨在評估不同濃度的菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細胞生物學行為的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞及藥物 人宮頸癌Hela細胞株購自中國科學院細胞庫，菟絲子乙醇提取物由浙江中醫藥大學中藥炮制實驗室制備并提供，生藥濃度為0.3 g/ml。

1.2 實驗試劑及儀器 DMEM細胞培養基與FBS購自上海浩然生物技術有限公司，MTT試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購自上海優予生物科技有限公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒與ECL化學發光液購自上海恒斐生物科技有限公司，Transwell培養小室購自上海銳賽生物技術有限公司。兔抗人Caspase-3單克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔二抗購自北京百奧萊科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菟絲子乙醇提取物的制備 菟絲子乙醇提取物由浙江中醫藥大學中藥炮制實驗室制備并提供，制備方法為：30 g菟絲子生品藥材經粉碎機粉碎，過40目篩，稱重定量后放入500 ml的95%乙醇內，浸泡30 min，回流提取3次，每次提取60 min，混合3次濾液并過濾得到醇提液，使用旋轉蒸發儀減壓回收乙醇，隨后在真空環境下（溫度60℃，真空度0.1 mpa）干燥3～4 d，將得到的乙醇提取物加入100 ml純水溶解，經0.2 μm濾菌膜抽提過濾，定容為100 ml放入棕色瓶中，封口膜密封避光保存，生藥濃度為0.1 g/ml。

1.3.2 宮頸癌Hela細胞的培養 將Hela細胞置于高糖DMEM完全培養基（含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml、10%FBS）中培養，置于恒溫箱 37 ℃、體積分數為5%CO2的培養箱中培養，隔日換液，當細胞生長密度達到80%～90%時，取處于對數生長期的Hela細胞進行傳代培養。

1.3.3 實驗分組及細胞周期檢測 將培養好的細胞充分混勻后鋪到96孔板細胞培養板，分為5組，對照組僅給予1%DMSO，其余4組為實驗組，分別加入3.125、6.25、12.5、25 mg/ml的菟絲子乙醇提取物。收集培育48 h后的各組細胞，用0.25%胰酶消化，以1 500 r/min離心10 min，去上清液，PBS洗滌2次，棄上清液，加預冷乙醇溶液70%振蕩，4℃過夜。再用PBS洗滌1次后室溫條件下加碘化丙啶30 μl/管，染色20 min，最后采用流式細胞術檢測細胞周期。

1.3.4 MTT比色法檢測細胞增殖能力 取對數生長期的Hela細胞消化制備單細胞懸液，以每孔4 000個細胞接種于96孔板中，每組設5個復孔，1個對照孔；置于恒溫37℃、體積分數5%的CO2培養箱中培養12、24、48 h。48 h后加入5 mg/ml的 MTT 溶液 10 μl，37 ℃孵育4 h后棄上清液，每孔中加入200 μl DMSO溶解結晶，12 h后用570 nm波長測定各孔吸光度值，求其平均值。每個藥物濃度設平行3孔。細胞生長的抑制率（%）=（對照組吸光度值-實驗組吸光度值）/對照組吸光度值×100%。

1.3.5 Transwell遷移和侵襲實驗 收集各濃度菟絲子乙醇提取物處理48 h后的Hela細胞，制備成1×105個/ml的單細胞混懸液。實驗組Transwell上室中加入200 μl的細胞懸液，下室加入含10%FBS的DMEM高糖培養基，培養24 h后取出，擦去上室內表面細胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色30 min，蒸餾水沖凈浮色，光鏡（×200）下計數至少5個視野中的穿過濾膜的細胞個數，以平均細胞數表示細胞遷移能力。將50 mg/L的基質膠均勻鋪在Transwell小室的上室底部，過夜干燥，其他步驟與遷移實驗相同。光鏡（×200）下計數至少5個視野中穿過濾膜的細胞個數，以平均細胞數表示細胞侵襲能力。

1.3.6 Western blot檢測細胞蛋白的表達 收集各濃度菟絲子乙醇提取物處理48 h后的Hela細胞，棄培養基，預冷PBS清洗3次，加入含有10%蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解細胞。收集細胞裂解液，使用蛋白提取試劑盒，采用BCA法測定蛋白質濃度后進行SDS-PAGE電泳。電泳后采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，加入封閉液室溫搖床封閉2 h。次日加入一抗 Caspase-3 單克隆抗體（1∶1 000）、Bcl-2單克隆抗體（1∶1 000）及 GAPDH 多克隆抗體（1∶1 000），室溫孵育 4 h，PBST 洗膜后加入相應的二抗（1∶500），室溫孵育2 h。PBST洗膜后，PVDF膜置于膠片上，蛋白面朝上滴加適量的ECL發光液并迅速放入凝膠成像儀中成像分析測定各條帶面積灰度值，重復3次，以平均數表示最終實驗結果。

1.4 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌Hela細胞的生長曲線及形態學觀察 宮頸癌Hela細胞的生長曲線呈典型的“S”形，前2 d的細胞量略有降低，可能與部分細胞死亡有關。從第3天開始，細胞進入對數生長期，第7天達高峰；隨后逐漸降低（圖1a）。給予不同濃度的菟絲子乙醇提取物后，實驗組細胞貼壁生長，在高倍鏡（×100）下觀察部分Hela細胞形態皺縮、個別細胞出現破碎或星狀突，細胞間隙增寬（圖 1b）。

圖1 宮頸癌Hela細胞的生長曲線（a）及形態學觀察（b）

2.2 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細胞周期的影響 見表1。

由表1可見，宮頸癌Hela細胞經不同濃度菟絲子乙醇提取物作用后，25 mg/ml組G2/M期的細胞數比例顯著高于其余各組，G0/G1期的細胞數比例顯著低于其余各組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與對照組相比，僅12.5、25 mg/ml組G2/M期的細胞數比例顯著增加，G0/G1期細胞比例下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表1 不同濃度菟絲子乙醇提取物對Hela細胞周期的影響（h）

2.3 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細胞增殖的影響 見表2。

表2 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細胞不同時間點增殖抑制率的影響（%）

由表2可見，在培養12 h時，不同濃度的菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細胞的增殖抑制率在各組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。培養24 h后，25 mg/ml組宮頸癌Hela細胞的增殖抑制率均顯著高于其余各組（均P＜0.05）。3.125 mg/ml組和 6.25 mg/ml組不同時間點宮頸癌Hela細胞的增殖抑制率差異均無統計學意義（均P＞0.05）。12.5 mg/ml組宮頸癌Hela細胞的增殖抑制率在24、48 h之間差異無統計學意義（P＞0.05），但均顯著高于12 h的增殖抑制率（均P＜0.05）。25 mg/ml組宮頸癌Hela細胞的增殖抑制率隨著時間的延長顯著增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.4 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細胞遷移及侵襲能力的影響 見表3。

由表3可見，在遷移實驗中，3.125 mg/ml組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），其余各組穿透小室的細胞數均小于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。25 mg/ml組穿透小室的細胞數均低于其余各組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表3 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細胞遷移及侵襲能力的影響（105/ml）

2.5 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細胞凋亡相關蛋白的影響 見表4、圖2。

表4 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細胞凋亡相關蛋白的影響

圖2 不同濃度菟絲子乙醇提取物的電泳圖

由表 4、圖 2 可見，48 h 后，12.5、25 mg/ml組的宮頸癌Hela細胞中促凋亡蛋白Caspase-3表達均較對照組增加（均P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表達均較對照組降低（均P＜0.05）。其中25 mg/ml組的Caspase-3表達水平均高于其余各組，Bcl-2表達水平均低于其余各組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

3 討論

菟絲子在中國被廣泛使用了數千年，具有抗生殖、改善內分泌及雌激素樣作用，除此之外，菟絲子還具有抗衰老、抗氧化、免疫調節等諸多作用[5-6]。既往表明，菟絲子可以通過調節雌激素受體和黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）參與下丘腦－垂體－卵巢軸（hypothalamic-pituitary-ovarianaxis，HPOA）軸治療卵巢內分泌和生殖功能障礙，對內分泌和免疫功能產生影響[6]，而宮頸癌與雌激素密切相關，但是尚未發現有菟絲子對宮頸癌的相關研究。因此，本研究擬通過菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細胞生物學行為的影響尋找相關作用機制。

以往研究顯示在菟絲子提取物中主要包括黃酮、蘆丁、異鼠李素、少量金絲桃苷和山奈酚等成分。根據高效液相色譜的結果，黃酮是主要的活性成分[7-8]。而中藥單體成分中黃酮類物質已經被廣泛證實具有抗血管生成、舒張血管、抗細菌和病毒感染、抗腫瘤等生物活性作用[9-10]。本研究結果顯示不同濃度的菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細胞的細胞周期及增殖均有影響，濃度較高的菟絲子乙醇提取物可以將Hela細胞阻滯在G2/M期，并且增殖抑制率具有隨時間劑量的依賴性。這與國內的部分研究結果相似[11-12]，郭澄等[11]的研究發現菟絲子中提取的黃酮成分對腫瘤壞死因子的抑制率達到18.3%～36.3%，認為中藥菟絲子具有抗腫瘤作用。金松等[12]的研究也顯示菟絲子可以有效抑制胃癌細胞的增殖和遷移。

本研究結果顯示菟絲子乙醇提取物能夠以劑量和時間依賴的方式抑制Hela細胞的遷移和侵襲能力，這與之前的研究一致[13]。Ray等[13]的研究顯示Hela細胞通過中藥提取物黃酮成分處理24 h后，通過激活p53和p21使細胞周期停滯。其中p21過表達時可通過與多種細胞周期蛋白/CDK復合物的相互作用引起細胞周期停滯。并且p21作為一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，在細胞應激或DNA損傷后被p53上調。研究也顯示DNA損傷可導致腫瘤抑制蛋白p53水平升高，誘導G1期、G2期或S期細胞周期停滯，并使DNA修復發生[14]，由于p53介導的p21活化是改變癌細胞生長的關鍵，因此筆者推測菟絲子提取物對Hela細胞周期的阻滯可能與Hela細胞中p53依賴性調節有關[15]。

腫瘤細胞轉移是由一系列涉及細胞遷移、侵襲和黏附的復雜過程組成[16]。為了檢測菟絲子乙醇提取物對Hela細胞的抗轉移活性。本研究進行了Transwell侵襲和遷移體外試驗，結果顯示與對照相比，高濃度的菟絲子乙醇提取物限制了Hela細胞的侵襲和遷移。既往研究認為MMP-9和MMP-2的抑制可以顯著減少宮頸癌細胞的腫瘤侵襲和轉移[17]。國內研究也顯示中藥成分中的黃酮類成分可以有效抑制MMP-9和MMP-2蛋白的表達[18]。

既往大量研究顯示細胞周期停滯和細胞凋亡相互關聯[19]。本研究中還發現隨著菟絲子乙醇提取物濃度的增加，Hela細胞中促凋亡蛋白Caspase-3表達量逐漸上升，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調。眾所周知，Bcl-2家族蛋白和Caspase-3家族蛋白在細胞凋亡中發揮重要作用，其中Bcl-2家族蛋白成員通過調節線粒體外膜通透性來控制線粒體凋亡途徑[20]。Bcl-2的表達降低時會導致線粒體膜的去極化，通過激活半胱天冬酶級聯和釋放細胞色素C等促凋亡因子導致線粒體基質擴增，從而調控細胞凋亡[20]。Caspase-3也是凋亡的典型標志物，是凋亡過程中的主要終末執行酶，在某些與細胞解體和凋亡體形成相關的過程中必不可少[21]，研究顯示Caspase-3可以降解多聚ADP-核糖聚合酶等抑制DNA復制和修復，并干擾mRNA的剪切，使細胞表現出染色體固縮，DNA片段化等凋亡特征，進而形成凋亡小體[21]。

總之，本研究結果顯示高濃度的菟絲子乙醇提取物可以通過阻滯細胞周期于G2/M期，抑制Hela細胞的侵襲和遷移，通過促進Caspase-3上調和Bcl-2下調促進Hela細胞凋亡，提示高濃度的菟絲子乙醇提取物有望成為抗宮頸癌藥物的可能。