自制血管保護套聯合負壓封閉引流治療兔下肢血管裸露創面的實驗研究

周化騰 胡文躍 杜偉斌 胡華輝 蔡兵兵 王利祥

負壓封閉引流（vacuum-assisted closure，VAC）是一種利用負壓吸引裝置在創面處形成負壓，持續引流吸除滲液，促進創面愈合的治療技術[1]。VAC已經廣泛應用于深度燒傷、糖尿病足潰瘍、開放性骨折等所致的四肢皮膚軟組織缺損，甚至肌腱裸露創面[2-4]。盡管如此，VAC技術用于血管裸露創面仍具有極大風險。對于此類創面，如何在使用VAC徹底引流的同時確保裸露血管通暢和完整，對于擴大VAC技術的適應證，豐富臨床治療手段具有重要意義。目前國內外關于VAC技術治療血管裸露創面的報道較少。本實驗以自制血管保護套聯合VAC技術治療兔下肢血管裸露創面，觀察治療后兔下肢血管通暢率、創面愈合率及愈合質量，探討該方法的安全性及有效性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及儀器 清潔級新西蘭家兔24只，體重3.0～3.5 kg，不分雌雄，由杭州余杭科聯兔業有限公司提供[動物合格證號：SYXK（浙）2017-0004]。飼養環境溫度20～25℃，相對濕度50%～70%。負壓吸引裝置購自韓國大熊制藥有限公司，生理采集系統（BL-420S）購自成都泰盟軟件有限公司。自制血管保護套材質為醫用硅膠，外徑6 mm，內徑4 mm。本研究經浙江中醫藥大學實驗動物中心倫理委員會審查通過。

1.2 動物分組與造模 24只新西蘭家兔采用隨機數字表法分為模型組、VAC組、聯合治療組，每組8只。禁食6 h后，家兔以3%戊巴比妥行耳緣靜脈注射麻醉，右大腿內側區域備皮、消毒，仰臥位固定。右大腿內側設計3 cm×4 cm創面，切除皮膚及部分淺筋膜，游離并充分暴露股動脈，創面徹底止血。術后家兔繼續單籠飼養，術后3 d每天肌肉注射青霉素80萬U。

1.3 創面處理 造模成功后，模型組家兔創面予0.9%氯化鈉溶液紗布濕敷，術后當天開始換藥治療，以0.9%氯化鈉溶液清洗創面，聚維酮碘消毒后，無菌紗布敷料覆蓋，并以生物膜覆蓋固定敷料。VAC組創面以相應大小的VAC敷料覆蓋，敷料周邊與創緣縫合固定，95%乙醇溶液擦拭創緣皮膚后，以生物膜完全密封創面；安裝吸引盤并聯通負壓吸裝置，調整負壓為-120 mmHg，維持負壓吸引。聯合治療組先以長度為2 cm的血管保護套覆蓋裸露的股動脈，再按前述方法安裝負壓吸引裝置，同樣維持-120 mmHg負壓吸引。若發現貼膜漏氣或引流管堵塞，則及時更換貼膜或VAC敷料。分別于治療后第7、14天行創面換藥、拍照。

1.4 評價方法

1.4.1 大體觀察 觀察創面水腫、滲出、肉芽生長情況以及裸露血管形態。

1.4.2 創面愈合率測定 分別于治療后第7、14天用無延展性透明膜覆蓋于創面上，描繪各組創面輪廓并掃描錄入計算機，以MIG2000軟件計算各創面面積。愈合率=（治療前創面面積-治療后創面面積）/治療前創面面積×100%。

1.4.3 創面裸露血管鏡下觀察 治療后第14天，切取創面中裸露的股動脈節段，光學顯微鏡下觀察血管形態、管壁厚度、管腔通暢及血栓情況。

1.4.4 創面組織新生血管相關基因表達水平檢測 采用RT-qPCR法檢測創面組織。切取創面組織及創緣2 mm正常皮膚，按照Trizol試劑盒（大連寶生物工程有限公司）說明從組織標本提取RNA，用紫外分光光度計檢測提取到的RNA濃度。使用RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒（美國Thermo Scientific公司）合成cDNA。采用 SYBRRGreen Realtime PCR Master Mix（日本TOYOBO公司）試劑盒進行RT-qPCR，由杭州赫貝科技有限公司完成。每個反應使用0.5 μl cDNA樣品。所有反應均在ABI 7500 Fast儀器上進行，并通過ABI Relative Quantification Study software（美國 Applied Biosystems公司）進行分析。PCR反應設立陽性對照組，并用雙蒸水作為cDNA的陰性對照。以管家基因β-actin作為內參，并經過至少3次獨立分析驗證?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCT進行計算，所使用的引物見表 1。

表1 新生血管相關基因PCR擴增用引物

1.5 統計學處理 采用Graphpad Prism 7.04統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；組內比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 24只家兔飼養良好，實驗過程中均未出現死亡。模型組未出現敷料松脫現象；VAC組和聯合治療組各有1只在術后3 d內出現VAC引流管堵塞，均及時發現并重新更換VAC敷料或貼膜。

2.2 創面大體觀察 治療后第7天聯合治療組和VAC組家兔創面水腫、滲出以及肉芽生長情況均好于模型組，聯合治療組家兔創面血管受壓情況好于VAC組和模型組。治療后第14天聯合治療組家兔創面肉芽生長情況及血管受壓情況好于VAC組和模型組。3組家兔治療后第7、14天創面情況見表2。

2.3 創面愈合率比較 治療后第7、14天聯合治療組家兔創面愈合率均高于VAC組和模型組，VAC組家兔創面愈合率均高于模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。治療后第14天3組家兔創面愈合率均高于治療后第7天，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

2.4 創面裸露血管鏡下所見 鏡下見VAC組家兔血管扁平，管壁增厚，管腔部分或完全阻塞，內見血栓伴機化；而聯合治療組家兔血管形態無異常，管壁無明顯增厚，管腔通暢，無明顯血栓（圖1）。

2.5 新生血管相關基因表達水平比較 3組家兔治療后第7、14天新生血管相關基因表達水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。治療后第7、14天聯合治療組新生血管相關基因表達水平均高于VAC組和模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表4。

3 討論

血管裸露是臨床上VAC應用的高風險因素[5]。理論上，VAC的負壓將形成對裸露血管的壓迫，從而導致血管變形，進而閉塞。本實驗通過動物造模，形成裸露血管創面，評估VAC對裸露血管的影響。實驗結果顯示治療后第14天，VAC組創面裸露血管部分或完全阻塞，證實了VAC對血管的壓迫。為了解決VAC對裸露血管的影響，筆者選用具有良好生物相容性的醫用硅膠自制血管保護套，并在實驗中調整材料參數，確保該血管保護套既能夠容納血管，又能形成一定的支撐，以使血管免于直接壓迫。本實驗顯示使用了血管保護套的聯合治療組家兔創面裸露血管鏡下通暢情況優于VAC組和模型組，說明了血管保護套的有效性。血管保護套的應用，將使血管裸露不再成為VAC應用的禁忌。

表2 3組家兔治療后第7、14天創面大體觀察比較

表3 3組家兔治療后第7、14天創面愈合率比較

圖1 創面裸露血管鏡下所見[a：負壓封閉引流（VAC）組；b：聯合治療組；×10]

表4 3組家兔治療后第7、14天新生血管相關基因表達水平比較

此外筆者還進一步評估了血管保護對局部創面愈合的影響。本實驗選取與新生血管密切相關的4個基因，用來評估保護血管對創面血供的影響。CD31存在于血小板、中性粒細胞、單核細胞和某些類型的T細胞表面，參與血管生成和整合素的激活。VEGF是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用[6]。PDGF是貯存于血小板α顆粒中的一種堿性蛋白質，是低分子量促細胞分裂素[7]，而ephrin B2是血管發生的關鍵基因之一[8]。檢測創面組織中新生血管相關基因表達，結果顯示聯合治療組上述基因表達水平均高于VAC組，說明血管保護套聯合VAC治療比單純應用VAC治療的創面在愈合過程中有更多的新生血管。更多的新生血管意味著更好的血供，血供的改善將進一步促進創面的愈合。進一步的實驗也證實，聯合應用血管保護套和VAC，比單純VAC治療具有更高的創面愈合率。以上結果說明對裸露血管的有效保護，不僅能保證下肢的血供不受影響，更具有潛在的通過改善局部血供促進創面愈合的作用。

人的股動脈由旋股外側動脈、肌皮穿支走行至皮膚，為局部皮膚提供血供，在本實驗中，兔股動脈也同樣存在類似的皮支。筆者推測，血管保護套保護創面裸露血管，能確保周圍皮膚組織的血供，從而促進創面愈合。但是，該推測的直接證據尚不充分，有待進一步研究證實。此外，本研究對血管組織結構分析不足，有待后續研究補充相關數據，如血管組織切片等，以更好地評估血管保護套聯合VAC治療對血管結構的影響。

綜上所述，本實驗通過血管保護套聯合VAC治療血管裸露創面，證實VAC對血管的壓迫，以及應用血管保護套可有效避免血管受壓，而對血管的保護能進一步改善創面血供，促進創面愈合。本實驗為臨床VAC技術的正確應用提供了有益的參考，同時也為血管裸露創面的治療提供了一種可以選擇方式。