染色體微陣列分析技術產前診斷胎兒先天性肺囊性腺瘤樣畸形的應用價值

王榮躍 樓文文 宮劍 黃賢蘋 許張曄

先天性肺囊性腺瘤樣畸形（congenital cystic adenomatoid malformation，CCAM）是一種以肺組織多囊性腫塊伴有支氣管結構增生為特征的病變，病變組織由肺循環供血，80%位于單側，20%位于雙側[1]。CCAM發病率為1/35 000～1/25 000[2]，男女發病率相似。產前CCAM可引起胎兒水腫、羊水過多、縱隔移位或消退[3]。染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）技術可用來檢測染色體微缺失、微重復[4]，已應用于發育遲緩、智力障礙患兒的診斷[5]和先天性異常胎兒的產前診斷[6-7]，可檢測＞100 k的拷貝數變異（copy number variation，CNV）[8-9]，優于傳 統 的 細 胞 遺 傳 學 核 型 分 析。為探討CNV與CCAM之間的關系，本研究采用CMA技術對超聲診斷CCAM的胎兒進行全基因組檢測，從而指導母兒預后情況的判斷。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年3月至2019年12在本院就診的產前超聲診斷胎兒為CCAM的孕婦23例。孕婦年齡17～42（29±5）歲，胎齡17～30+6（19±3）周。根據胎兒是否合并其他結構異常，分為單純性CCAM 19例和非單純性CCAM 4例。本研究經醫院醫學倫理委員會審查通過，所有胎兒父母均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 胎兒CCAM診斷 產前胎兒CCAM診斷由兩位經驗豐富的超聲科醫師會診確診，必要時行胎兒胸部MRI檢查。

1.2.2 產前診斷方法 超聲檢查提示患有CCAM的胎兒，征得孕婦以及家屬同意并簽署產前診斷知情同意書，采用羊膜腔穿刺術或臍靜脈穿刺術取得胎兒標本進行CMA檢測。

1.2.3 DNA提取 采用Qiagen試劑盒（美國Qiagen公司）從臍血（0.5 ml）和羊水（10 ml）中提取基因組 DNA。如需排除母血污染和解釋意義不明的CNV時，則提取父母的外周血標本的基因組。

1.2.4 染色體核型分析 對臍血或羊水進行培養、收獲、染色、滴片后，再行染色體核型分析。

1.2.5 CMA檢測 嚴格按照美國Affymetrix公司提供的標準流程進行操作，對基因組DNA進行消化、擴增、純化、片段化、標記、與芯片雜交、洗滌及芯片掃描，所使用的芯片為全基因組CytoScan 750K芯片（美國Affymetrix公司）。該芯片同時具備單核苷酸多態性探針和寡核苷酸探針。

1.2.6 數據分析 應用配套的CHAS軟件及相關的生物信息學方法分析CMA的檢測結果，根據DNA片段拷貝數的散點圖分布判斷CNV及染色體微缺失、微重復。根據文獻及公共數據庫分析＞100 kb的CNV的臨床意義，CNV比對分析過程中所參考的數據庫包括人類基因組結構變異數據庫（DGV）數據庫（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/）、疾病相關 CNV 數據庫（DECIPHER）（https://decipher.sanger.ac.uk/）、人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM）（https://www.omim.org）等。根據CNV的性質不同分為良性CNV、致病性CNV和臨床意義不明確的CNV（variants of uncertain significance，VOUS）。

1.2.7 CNV的驗證 對含有致病性CNV及VOUS胎兒的父母外周血樣本行CMA分析，進一步明確CNV是遺傳還是新發，協助判斷CNV的性質。

1.2.8 隨訪時間 產前超聲診斷CCAM的胎兒并分娩的，隨訪至出生6個月，了解其出生后CCAM情況。

2 結果

2.1 產前診斷CCAM胎兒的一般情況 4例非單純性CCAM胎兒合并其他異常，其中合并胎兒生長受限1例，羊水過少2例，心臟移位并羊水過多1例。

2.2 CMA檢測結果 23例胎兒的基因組均存在CNV，每例胎兒的基因組含有1～5個CNV，片段大小為300 kb～6.20 Mb。3例胎兒檢出致病性CNV，檢出率為13.0%；單純性CCAM胎兒與非單純性CCAM胎兒的致病性CNV檢出率分別為10.5%（2/19）和25.0%（1/4）。3例胎兒相關情況見表1。17q12微缺失區段包含腎囊腫和糖尿病（renal cysts and diabetes，RCAD）綜合征的關鍵區域1.60 Mb的微缺失（圖1）。17p12微缺失區段包含遺傳性壓力易感性周圍神經病（hereditary neuropathy with liability to pressure palsies，HNPP）綜合征的關鍵區域1.40 Mb微缺失（圖2）。Xq27.1q28微重復區域包含關鍵基因SOX3基因。經過父母驗證后VOUS檢出率為8.7%（2/23），VOUS檢測情況見表 2。

2.3 妊娠結局情況 19例單純性CCAM胎兒引產1例，分娩18例；4例非單純性CCAM胎兒引產1例，分娩2例，失訪1例，見表3。20例CCAM胎兒出生后經過 6個月隨訪，7例（35.0%）自發消退；5例（25.0%）接受了手術治療，術后恢復良好；8例（40.0%）分娩后CT檢查仍有CCAM，但拒絕手術仍在隨訪中。

3 討論

2013年美國婦產科協會（ACOG）建議將染色體微陣列基因芯片技術分析應用于產前診斷，指出若超聲診斷胎兒結構異常并同意行侵入性產前診斷的，用CMA可替代染色體核型分析[10]。Liao等[11]對超聲異常但染色體核型分析正常的446例胎兒中進行CMA檢測，發現11.4%的胎兒存在致病性CNV。通過CMA檢測可發現出生缺陷相關的致病基因，如在先天性食管閉鎖胎兒中通過CMA檢測發現了GL13基因變異[12]，在骨骼發育異常的胎兒中通過CMA檢測發現了PPKAR1A基因、MITF基因變異[13]。本研究使用全基因組CytoScan 750K芯片對23例伴或不伴其他超聲結構異常的CCAM胎兒進行檢測，結果顯示致病性CNV的檢出率為13.0%，與Deng等[14]報道基本一致。

表1 致病性CNV的CMA檢測結果

圖1 病例1染色體17q12區域發生1.60 Mb的微缺失

圖2 病例2染色體17p12區域發生1.40 Mb微缺失

表2 VOUS檢測結果

表3 CCAM胎兒妊娠結局情況

本研究顯示單純性CCAM胎兒與非單純性CCAM胎兒的致病性CNV檢出率分別為10.5%和25.0%。單純性CCAM胎兒中發現的兩個致病性CNV與CCAM的發生不一定有關，但有可能是潛在危害健康的原因。

本研究中病例1在17q12染色體上存在1.60 Mb微缺失，與RCAD綜合征（OMIM 137920）相關。RCAD綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，其特征是腎發育異常（特別是多發性腎囊腫、腎小球囊性病變、腎發育不良）和糖尿病[15]。Donnelly等[16]研究中提示17q12微缺失是產前超聲異常中僅次于22q11微缺失綜合征的第二常見的基因芯片異常。RCAD綜合征的發生與HNF1B（OMIM 189907）基因缺失相關[16]。Jain等[17]在正常胎兒的肺、肝、胰腺和胃中檢測到HNF1B mRNA，該夫婦經過充分的遺傳咨詢后，不愿意接受有可能表現異常的胎兒，回當地醫院引產。

本研究中病例2在17p12染色體上存在1.40 Mb微缺失，與HNPP綜合征（OMIM 162500）相關，HNPP綜合征表現為復發性局灶性運動和感覺性周圍神經病[18]，呈常染色體顯性遺傳，輕微外傷可引起局灶性脫髓鞘性神經病發作[19]。該夫婦家庭經濟條件差，經過充分遺傳咨詢后仍堅決要求引產。本研究中病例3在Xq27.1q28染色體上存在9.53 Mb微重復，包含SOX3（OMIM 313430）基因，會引起垂體功能下降，經過遺傳咨詢后，該夫婦有宗教信仰，要求繼續妊娠，分娩后予門診隨訪未見新生兒有異常表型，無特殊面容，發育接近正常同齡兒，仍在隨訪中。

CCAM的預后主要取決于其在宮內是否合并其他相關畸形。大多數病變會在出生后的第1年持續存在，會增加肺部感染的風險，Davenport等[20]推薦積極手術治療。然而，Calvert等[21]發現在出生后的第1年，CCAM會自發消退，他們主張對無癥狀嬰兒進行密切隨訪，并對持續性病變進行再次檢查。本研究中，25.0%（5/20）的胎兒分娩后進行了手術，術后恢復良好；35.0%（7/20）的胎兒分娩后在生后3～6個月左右病變自發消退。由于本研究病例數較少，需要進一步擴大病例數才能更好得出結論。但是這個結果可能有助于增加孕婦繼續妊娠的信心，尤其是對于那些懷有單純CCAM并且CMA結果陰性的胎兒孕婦。

綜上所述，CMA技術能檢出部分致病性CNV，即亞顯微染色體異常，能更好地指導及提高CCAM病變的產前咨詢及管理，避免過度引產。