類風濕關節炎動物模型研究進展

夏 晴，紀羽婷，劉海亮，宋武琦

(哈爾濱醫科大學微生物學教研室，伍連德研究所，黑龍江省免疫與感染重點實驗室， 黑龍江省普通高校病原生物學重點實驗室，哈爾濱 150081)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性關節疾病，表現為持續性滑膜炎、全身性炎癥，伴有骨骼和軟骨侵蝕，最終可導致關節強直和畸形[1]。我國RA患病率約為0.32%～0.36%，在自然病程中，10年致殘率可超過60%[2]。類風濕關節炎動物模型被廣泛用于發病機制和治療方法的研究。目前已經建立多種動物模型用于研究RA的病因、發病機制、影響因素以及新的治療靶點的研究和新療法的評估，包括佐劑誘導關節炎模型(adjuvent induced arthritis，AA)、II型膠原誘導的關節炎模型(collagen induced arhritis，CIA)、鏈球菌細胞壁誘導的關節炎模型、軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix proteins，COMP)誘導關節炎、降植烷誘導關節炎(pristane induced arthritis，PIA)以及轉基因動物的關節炎模型。這些模型各有優缺點，但CIA一直是RA研究最廣泛的模型。將上述中因誘導產生的模型稱為誘導型關節炎模型，另一類為基因工程型動物模型，按照這兩大類來進行介紹。

1 誘導型關節炎模型

佐劑誘導的關節炎動物模型最初由細菌學家Freund于五十年代創立，又稱弗氏佐劑性關節炎。使用弗氏佐劑單次皮下注射可誘導Wistar大鼠發生關節炎，并且多次注射發病率高于單次注射[3]。發病快，在很短的時間內就可觀察到病變，可觀察到腳踝、爪子、尾巴的腫脹，累及單個或多個關節；組織學可觀察到血管翳的形成、中性粒細胞和單核細胞浸潤，有軟骨和軟骨下骨侵蝕，隨后伴有關節強直，病變多持續14～45 d，觀察不到慢性活動期。隨后，Trentham等[4]在1977年提出，通過背部皮下注射II型膠原與完全或不完全弗氏佐劑混合物，可誘導10～24周齡大的遠系雜交Wistar 雌鼠、SD大鼠、近交系Wistar-Lewis大鼠發生關節炎。病變主要累及遠端踝關節、跗關節和趾間關節；嚴重程度峰值出現在發病后4 d內，腫脹維持5～8周，最終導致關節變形。無論是異源或同源型II型膠原作為免疫原，還是采用完全弗氏佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)或不完全弗氏佐劑(incomplete freund’s adjuvant，ICFA)作為免疫原，膠原誘導的關節炎的臨床特征是相似的，大鼠對同源或異源的II型膠原具有同樣的易感性[4]。1980年Courtenay等[5]提出使用II型膠原誘導小鼠關節炎模型。通過背部皮下注射牛II型膠原在近交系8～15周齡DBA/1小鼠中誘導關節炎，多在免疫后23 d后發病，早期觀察到滑膜及其周圍組織水腫，接著伴隨滑膜增生，單核細胞浸潤；病變后期，細胞浸潤和水腫減輕，有關節強直，可見滑膜和關節軟骨破壞，椎體很少受累，少數動物的耳朵或尾巴偶見小的炎性病灶[5]。在刺激前后給予小鼠脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可誘導疾病發生得更快，起病變異性更小[6]。II型膠原誘導的大小鼠關節炎的主要病變相似，且均與人類RA有許多相似之處。但二者免疫不同，DBA/1小鼠初次免疫必須使用完全弗氏佐劑而不是不完全弗氏佐劑，CIA誘導小鼠關節炎起病慢，病程長[7]。近年來，CIA模型在基于生物學的新療法的測試和開發中發揮了重要作用，如針對TNF-α的治療[8]。

膠原誘導關節炎動物模型的易感性與主要組織相容復合物(major histocompatibility complex，MHC)的特定II類分子如H-2r 和 H-2q有關，同樣，人RA的易感性也與MHC II類分子H-2r 和 H-2q相關。在這兩種疾病中，都有針對CII和類風濕的自身抗體產生的因素，有證據表明，RA患者的抗體針對的是與CIA相同的CII分子區域[9-10]。

大鼠對佐劑誘導關節炎異常敏感，除了使用弗氏佐劑以外，非免疫原性佐劑如降植烷、角鯊烯均可以在大鼠品系中誘發嚴重的關節炎，且符合RA的標準[11]。大鼠單次皮下注射降植烷可以誘導PIA，小鼠需要注射兩次降植烷，時間間隔為50 d，然后是慢性復發期，該炎癥為T細胞依賴型，表現為關節炎癥的一個延長、延遲的臨床時間過程；組織學變現為滑膜增生、軟骨和骨糜爛、炎性細胞浸潤、血管翳形成；可以檢測到類風濕因子，熱休克蛋白和I、II型膠原抗體也被檢測到。非免疫原性佐劑關節炎表明，非特異性的免疫系統刺激可以引發關節炎。DA系大鼠對PIA最敏感，發病率可達100%，E3系最不敏感，發病率為0[12]。降植烷誘導的關節炎模型對TNF-α抑制劑療法不敏感，因此該模型可用于研究除TNF-α抑制劑療法以外的新方法，對于研究對TNF-α抑制劑療法無效的患者的相關治療方法是有重要意義的[13]。

COMP是一種軟骨特異性分子，可在幾種大鼠以及小鼠品系中誘發急性和自限性關節炎[14-15]，天然和變性COMP均可在大鼠中誘發嚴重關節炎，病變變現為滑膜中度增生、肥大，伴血管翳形成。雖然骨和軟骨的破壞是明顯存在的，但它們僅限于邊緣區，而整個關節結構只是偶爾被重塑。多數情況下，關節炎是逐漸愈合的，免疫后43 d沒有炎癥或畸形的跡象。疾病具有自限性，很容易在對CIA以及佐劑模型具有抗性的E3品系中誘導，這種差異不僅與RT1u單倍型有關，也與非MHC基因有關，表明，COMP依賴于獨特的疾病途徑。與天然COMP免疫誘導的關節炎類似，變性COMP免疫誘導的關節炎，但它往往更持久，特別是在E3品系。

研究發現[16]，II型膠原誘導大鼠關節炎，其血清經50%硫酸銨分級濃縮后，轉移至正常受體內，在18～72 h后可誘發關節炎，并且可以表現出早期炎癥病變的所有病理組織學特征，如巨噬細胞和中性粒細胞浸潤，但是炎癥短暫、不嚴重。轉移的血清中含有活性的IgG抗膠原蛋白抗體。該種方法所致關節炎為快速發病，疾病高峰期在8 d以內，而且具有高度的同步性，而CIA，在疾病的發生率、同步性和分布方面存在很大的個體差異。該方法還適用于免疫一些不適合進行CIA免疫的小鼠品系。

在誘導型關節炎模型的多種方法中(見圖1)，AA操作方法簡單，但是缺乏慢性病過程，病變具有一定的自限性，在病理生理學特點上存在較大差距；CIA誘導的關節炎發病時間與臨床表現不一，雖然與人類RA有很多相似之處，但是無病情波動和復發情況，沒有類風濕因子及抗核抗體，但它已經是目前公認的研究RA最佳模型，特別是在治療機制及免疫反應有關的研究中；降植烷誘導的關節炎模型耗時久，該模型主要依賴T細胞激活，主要用來藥物驗證；COMP誘導的關節炎發病較AA要快，起病急，病程短，雖然其外周關節病變在臨床上與RA相似，但不產生永久的關節破壞[17]。

重點介紹AA、CIA、PIA以及COMP誘導的關節炎其發病機制和主要病變可見表1[18-29]。

圖1 關節炎誘導流程圖Figure 1 Arthritis induction flow chart

2 基因工程型關節炎模型

小鼠在經過一定的基因修飾后可以自發形成關節炎，與依賴多基因性狀相比，靶向基因工程使自發性疾病模型的定義更狹窄，更簡單，也可進一步了解細胞因子在RA發展中的作用，下面介紹幾種基因修飾后的自發關節炎動物模型，如表 2所示。

通過RA患者分離的滑膜細胞進行體外研究，發現單核細胞/巨噬細胞產物腫瘤壞死因子(TNF-α)通過誘導促炎細胞因子級聯，在關節炎癥中起中心作用[30-32]。1991年構建人類TNF轉基因小鼠[33]，表現出人類TNF基因表達的失調模式，可發展為慢性炎性多關節炎，并且觀察到與人類RA相一致的組織學特征，滑膜增生，炎性細胞浸潤在不同的發育階段都很明顯；血管翳形成，關節軟骨破壞和大量纖維組織產生，與人類RA相一致的組織學特征，在疾病晚期被觀察到。該研究也證明了在轉基因小鼠中可以建立正確的、內毒素應答的和巨噬細胞特異性的人類TNF基因表達，并證明了人類TNF基因的3′-區域可能參與了巨噬細胞特異性的轉錄。隨后研究發現[34]，在C57B1/6 CBA小鼠的背景下，與BDA/1反向雜交產生一種TNF過表達的小鼠，其關節炎發病比前者要嚴重，可導致關節炎的發病加速，且持續幾代，就是說第一代發病在8～9周，意味著第11代可能是在第三周或者出生后11 d就發病。這些小鼠關節中淋巴細胞和巨噬細胞浸潤可表明，細胞因子的產生和隨后的關節損傷至少部分是通過成纖維細胞的TNF-α的異常表達產生的。通過體內注射人類TNF抗體可以預防小鼠中關節炎的發生并治療已發生的關節炎，這些結果為TNF在炎癥性關節炎發病機制中的作用提供了直接證據。抑制TNF可能被證明在設計這類疾病的治療方案中是有用的。

白介素-1(interleukin 1，IL-1)作為一種促炎因子，也參與人類RA的疾病進展，IL-1似乎特別重要，因為將IL-1注入正常兔關節會引起嚴重的關節炎[35]，并且將抗IL-1抗體或IL-1受體拮抗劑(ra)注入受影響的關節會改善疾病[36-38]。IL-1受體拮抗劑(ra)是其內源性抑制劑，為了闡明IL-1ra的作用，通過基因靶向構建IL-1ra缺陷型小鼠，IL-1ra缺陷小鼠是通過將分泌型的整個外顯子與neo基因進行同源重組而產生的[39]。在這些突變小鼠中，IL-1ra的四種亞型均被破壞。這些小鼠與BALB/cA或C57BL/6J品系小鼠回交5～8代，與BALB/cA小鼠回交5代后，IL-1ra-/-小鼠自發發展為慢性炎癥性關節炎，后肢的踝關節處的腫脹和發紅最為明顯，前肢的關節也發展為關節炎，發生率和嚴重性較低；組織學分析顯示滑膜和關節周圍炎癥；可看到包括淋巴細胞和嗜中性粒細胞在內的炎性細胞的入侵形成了血管翳，骨侵蝕也很明顯[40]。研究表明IL-1ra基因的缺乏會引起自身免疫性疾病和關節炎，強調IL-1/IL-1ra平衡在維持關節正常生理和免疫系統穩態方面的重要性。除此之外，發現C57BL/6J背景下的IL-1ra-/-小鼠在II型膠原免疫時發生關節炎的幾率很高，這表明IL-1ra-/-小鼠的免疫系統具有高反應性，我們還觀察到該疾病在DBA/1背景下的早期發病和更嚴重的表型[40]。

表1 誘導型類風濕關節炎動物Table 1 Induced rheumatoid arthritis animals

研究發現[41]，編碼T細胞中一個關鍵的信號轉導分子，ZAP-70 SH2結構域的基因發生了自發的點突變，導致BALB/c小鼠的慢性自身免疫性關節炎，稱為SKG關節炎模型。小鼠在2個月大時開始發病，X線檢查顯示，在8～12個月大時，軟骨下骨破壞和融合、關節脫位和骨質疏松癥。

除此之外還包括K/BxN模型[42]、Human/SCID嵌合體小鼠模型[42]和Human DR4-CD4小鼠模型[43]等。K/BxN模型小鼠關節炎屬于慢性進行性疾病，首先表現為關節腫脹，并發展到多個關節畸形嚴重損害活動能力的程度，關節受累明顯對稱，并顯示出明顯的遠端突出；組織學分析揭示了大量白細胞浸潤，滑膜炎，血管翳形成，軟骨破壞，骨質侵蝕繼而重塑和纖維化[42]。基因工程型關節炎模型更有助于研究某一特定因子或者基因在關節炎疾病中的作用，模型具有遺傳性，可以在后代中持續表達。

表 2 基因工程型類風濕關節炎模型Table 2 Genetically engineered rheumatoid arthritis model

3 結語

近年來，人們對于關節炎動物模型的研究逐漸增多，模型構建方法也從誘導型發展至基因工程修飾的小鼠動物品系。對動物模型的不斷深入研究，對于RA的發病機制、影響因素以及治療方法等多方面都發揮了至關重要的作用。多種類的動物模型，也使得研究更加精準，尤其新的基因工程模型，為一些靶點藥物研究提供了新思路。雖然目前對RA動物模型的研究較為廣泛，但模型都是在特定的條件下誘導產生，不能完全反應RA疾病過程中的所有影響因素，而且動物模型側重于嚙齒類動物，與人類還存在較大的種屬差異。所以研究出一種種屬與人類更貼近，操作更為便捷、經濟，更加全面反應人類RA疾病進展的動物模型是今后研究RA動物模型的重要內容之一。