乙醇誘導改性對乳清分離蛋白結構及乳化特性的影響

馮旸旸,王 浩,于 棟,徐敬欣,孔保華,劉 騫

(東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

乳清蛋白是干酪生產副產物中乳清的主要成分,其主要包含β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、牛血清白蛋白等組分。根據蛋白質濃度的不同可以分為乳清分離蛋白(Whey protein isolate,WPI)和乳清濃縮蛋白(Whey protein concentrate,WPC)[1]。乳清蛋白憑借其營養豐富、消化吸收率高的特點,享有“蛋白之王”的美稱,而且經常被作為功能性食品配料或添加成分用于食品工業中[2]。然而,由于β-乳球蛋白的結構缺陷,使得乳清蛋白具有一定的致敏性,極大地限制了其在食品工業中的應用范圍。因此,許多研究者嘗試采用不同的改性技術處理乳清蛋白,通過改變蛋白質的分子量、電荷分布、表面疏水性、空間結構等理化性質,進一步增強或改善其功能性質[3]。目前,常見的乳清蛋白改性技術主要集中于物理改性、化學改性以及酶改性等方面。其中,熱處理、超高壓和超聲波等物理改性技術主要通過改變乳清蛋白的結構和分子間作用力來達到改善其功能特性的目的[4-6];酰化、磷酸化或糖基化等化學改性技術主要通過修飾乳清蛋白氨基酸殘基的側鏈基團或促進二硫鍵的裂解,使表面電荷、空間結構等發生變化,從而達到改善其功能特性的目的[7-9];而酶法改性技術主要利用特異性酶制劑,誘導乳清蛋白分子的交聯或水解,從而實現其結構組成和功能特性的改變[10-11]。

近年來,相關研究表明,由于醇類的極性低于水,可以削弱穩定蛋白質結構的疏水相互作用,同時增強靜電相互作用,從而促進蛋白質的改性[12-13]。Lambrecht等[14]研究發現,利用50%(v/v)乙醇可以促使牛血清白蛋白分子間發生共價交聯,從而導致蛋白分子發生聚集。Peng等[15]研究發現,利用乙醇改性處理大豆β-伴球蛋白,能夠顯著誘導蛋白分子的聚集和變性,而且其效果具有乙醇濃度依賴性。然而,雖然相關研究已經證實,乙醇能夠導致蛋白質分子的聚集或變性,但是關于乙醇誘導改性提高乳清蛋白乳化特性,及其相關機制方面的研究甚少。基于此,本文利用不同濃度的乙醇(10%、30%、50%和70%,v/v)處理WPI,分析探討乙醇改性處理對WPI的分子結構和乳化特性的影響,并進一步闡明乙醇改性對WPI分子構效的影響機制,以期為改善WPI分子結構以及提高其乳化特性提供新的思路,并奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白(WPI,蛋白含量90%) 北京銀河路商貿有限責任公司;無水乙醇 天津市天力化學試劑有限公司;8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)、考馬斯亮藍R-250 美國Sigma公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基胺基甲烷(Tris) 北京索萊寶生物科技有限公司;鹽酸(HCl)、氫氧化鈉(NaOH)、磷酸氫二鈉 均為分析純;實驗用水 均為去離子水。

AL-104型精密電子天平 梅特勒-托利多儀器設備(上海)有限公司;JD500-2電子天平 鄭州南北儀器設備有限公司;HJ-6多頭磁力攪拌器 常州丹瑞實驗儀器設備有限公司;FE20K型pH計 上海梅特勒-托利多儀器設備有限公司;TU-1800 紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;F-380型熒光分光光度計 天津港東科技發展股份有限公司;圓二色光譜儀 英國應用光物理公司;T18勻漿機 德國IKA公司;Zetasizer Nano-ZS 型納米粒度及電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司;5500LS原子力掃描探針顯微鏡 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 用不同濃度的乙醇溶液(10%、30%、50%和70%,v/v)溶解WPI,同時以蒸餾水溶解的WPI作為對照組,將3%(w/v)溶液置于磁力攪拌器在室溫下攪拌4 h。用0.1 mol/L HCl將溶液pH調至7.0后,將蛋白溶液在室溫下用電風扇吹2～3 h去除殘留的乙醇,然后將各樣品凍干得到不同濃度乙醇改性處理的WPI樣品。

在測定改性后WPI的結構特性和功能特性之前,首先測定不同樣品的水分含量,然后用雙蒸水配制成10 mg/mL的溶液,用磁力攪拌器在室溫下攪拌2 h使其充分溶解,然后放置于4 ℃冰箱中12 h使其充分水合備用。

1.2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE) 對不同濃度乙醇改性處理的WPI樣品進行還原和非還原電泳實驗。將濃度為2 mg/mL的樣品溶液與蛋白溶解液(由0.25 mol/L pH=6.8的Tris-HCl,SDS,溴酚藍以及甘油配制而成)按1∶1比例混合(還原電泳實驗再添加10%的β-巰基乙醇),在沸水浴中煮3 min,冷卻至室溫備用。分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為5%,開始電泳時電壓為80 V,待樣品進入分離膠后改為120 V;電泳結束后,取出膠片加入染色液染色20 min,之后再用脫色液脫色。

1.2.3 圓二色譜測定 參考Cao等[16]的方法并作適當修改,用雙蒸水將樣品稀釋為0.5 mg/mL的待測溶液,將其注入光徑為1 mm的樣品池中,用圓二色譜儀進行掃描。以雙蒸水為空白,掃描范圍為190～250 nm,掃描速度為60 nm/min,累積掃描3次。利用圓二色譜Pro軟件分析計算得出樣品中各二級結構(α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲)的含量。

1.2.4 熒光光譜測定 使用熒光分光光度計對樣品溶液(1 mg/mL)進行熒光光譜掃描,測定樣品中色氨酸(Trp)殘基的變化。參數設置為:激發波長295 nm,掃描范圍300～400 nm,掃描速度240 nm/min,狹縫寬度10 nm。

1.2.5 紫外吸收光譜測定 用紫外可見分光光度計對樣品溶液(1 mg/mL)進行紫外光譜掃描。參數設置為:掃描范圍250～340 nm,掃描速率為中速,采樣間隔為1.0 nm,光徑為1 cm。

1.2.6 原子力顯微鏡觀察 利用原子力顯微鏡觀察樣品的微觀形貌。用雙蒸水將樣品稀釋為1 mg/mL的蛋白溶液,取樣20 μL 滴加在干凈的云母片上,室溫下干燥后選擇輕敲模式進行觀察,掃描范圍為2 μm×2 μm,使用NanoScope Analysis進行原子力顯微鏡數據分析。

1.2.7 粒徑和電勢測定 用納米粒度及電位分析儀測定不同的WPI樣品溶液(1 mg/mL)的粒徑和ζ-電勢,室溫條件下,每個樣品測量三次。

1.2.8 表面疏水性測定 利用熒光探針ANS法測定樣品的表面疏水性。將每組樣品溶液用雙蒸水稀釋成質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液,吸取每個濃度梯度的蛋白溶液2 mL,分別與20 μL 8 mmol/L的ANS溶液混合,室溫條件下暗反應20 min,隨后用熒光分光光度計測定熒光強度。測定參數設置為:激發波長390 nm,發射波長470 nm,狹縫5 nm,掃描速度240 nm/min。以蛋白質量濃度(mg/mL)為橫坐標,熒光強度為縱坐標,曲線初始段的斜率即代表蛋白的表面疏水性。

1.2.9 乳化特性測定 參考Chen等[17]的方法測定樣品的乳化活性(Emulsification activity index,EAI)和乳化穩定性(Emulsification stability index,ESI)。將2 mL菜籽油與8 mL WPI溶液(2 mg/mL)混合,用勻漿機在13500 r/min下勻漿2 min,然后立即從距離管底部0.5 cm處取50 μL新鮮乳狀液加入至含5 mL 0.1% SDS溶液的試管中,振蕩混勻后在500 nm處測定吸光值記作A0,取均質10 min后的乳狀液重復上述步驟記作A10。乳化活性EAI(m2/g)及乳化穩定性ESI(%)由以下公式計算得出:

其中,2為2倍;2.303為換算系數;C為蛋白濃度;φ為乳狀液中油相的體積分數(v/v,本實驗的油相體積分數為0.2);L為比色皿光徑(本實驗選用光徑為1 cm的比色皿);104為 cm2和 m2單位之間的換算值;D為稀釋倍數(本實驗的稀釋倍數為100);A0、A10分別為乳狀液0和10 min時在500 nm處的吸光值。

1.3 數據處理

每個試驗重復3次,結果表示為平均數±標準差。數據統計分析采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進行,差異顯著性(P<0.05)分析使用Tukey HSD程序。采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE

經不同濃度乙醇改性處理的WPI的非還原型(不添加β-巰基乙醇)和還原型(添加β-巰基乙醇)凝膠電泳圖譜如圖1所示。從圖1中可以看出,未經處理的WPI在分子量14和17 kDa處有明顯條帶,分別代表α-乳白蛋白和β-乳球蛋白,且由于WPI中含量較高的是β-乳球蛋白,所以β-乳球蛋白條帶顏色最深。不同濃度乙醇改性處理后,WPI沒有明顯的條帶消失或生成,說明乙醇改性處理沒有改變WPI的蛋白組成。但隨著乙醇濃度的增加,蛋白分子發生部分聚集,且在凝膠頂部出現大分子量聚集物,而在還原條件下(添加β-巰基乙醇),大分子或中間分子量復合物發生解離,則說明蛋白分子之間是通過二硫鍵而形成復合物,Lambrecht等[14]也報道50%(v/v)濃度的乙醇可顯著導致BSA間形成二硫化物鍵,而Nicolai等[18]也表示二硫鍵在乳清蛋白聚集的形成中起著重要作用。

圖1 不同濃度乙醇改性處理后乳清分離蛋白的非還原和還原凝膠電泳圖譜

2.2 圓二色譜

二級結構與蛋白質構象的穩定性和功能特性密切相關,圓二色譜已經廣泛用于蛋白質二級結構的研究[19]。如圖2(a)所示為不同濃度乙醇改性處理過的WPI的圓二色譜圖,從圖中可以看出,與對照組相比,處理組的峰形沒有發生明顯變化,均在195和208 nm附近分別出現一個正峰和一個負峰,但處理組的色譜圖相比對照組發生下移,說明乙醇改性處理會對WPI的二級結構產生一定影響。此外,波長208 nm附近的負峰代表二級結構中的α-螺旋,處理組的摩爾橢圓率[θ]值較對照組高,說明經乙醇改性處理后WPI的α-螺旋有所增加。

樣品各二級結構的具體相對含量可以通過圓二色譜Pro軟件分析,分析結果如圖2(b)所示,由圖可知,對照組的WPI以β-折疊為主,其含量為39.40%,該結果與單杰等[20]用傅里葉紅外光譜技術得到的WPI中β-折疊含量達40.67%相接近。與對照組相比,不同濃度乙醇改性處理的WPI二級結構中β-折疊含量均減少,α-螺旋含量均增加,在乙醇改性處理組中,隨著乙醇濃度的增加,β-折疊含量呈現先減少后增加的趨勢,α-螺旋呈現先增加后減少的趨勢,轉折點均出現在乙醇濃度為50%的處理組,此時β-折疊和α-螺旋相比對照組分別減少和增加了41.4%和29.4%。類似地,Shiraki等[21]也發現用乙醇改性處理β-乳球蛋白的過程中伴隨著β-折疊向α-螺旋的轉化,這可能是因為醇類極性低于水,而低極性的溶液環境更有利于分子內氫鍵的形成,也更容易維持α-螺旋結構的穩定[22]。此外,二級結構中β-轉角和無規則卷曲反映的是蛋白質分子的松散程度[23],處理組中β-轉角和無規則卷曲含量相比對照組增加,說明一定濃度的乙醇可以使蛋白質結構變得疏松,更有利于改善其乳化性能。

圖2 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白的圓二色譜(a)和蛋白二級結構含量(b)的影響

2.3 內源性熒光光譜

蛋白質的內源性熒光光譜可以有效反映其三級結構的構象變化情況。圖3所示是不同濃度乙醇改性處理的WPI的內源性熒光圖譜,由圖可以看出,與對照組相比,各處理組圖譜形狀均無顯著變化,但處理組的熒光強度值均高于對照組,且隨著乙醇濃度的增加,WPI熒光強度呈現先增大后降低的趨勢,當乙醇濃度為50%時熒光強度達到最大,相比對照組增加了36.90%(P<0.05),內源性熒光強度與蛋白結構中的色氨酸(Trp)密切相關[24],經適當濃度乙醇改性處理可以使WPI結構展開,該結果與二級結構中無規則卷曲的分析結果相吻合。蛋白分子結構展開后,內部Trp殘基的暴露導致熒光強度增加,Nor等[25]指出,芳香族氨基酸暴露的增加可以提高蛋白質在油水界面的吸附親和力,從而有利于改善其乳化特性。但是當乙醇濃度高于50%時,由于部分展開的蛋白質分子之間發生聚合,導致部分發色基團內包于蛋白分子內部進而發生熒光淬滅現象,而且由于蛋白質結構復雜,發色基團暴露在溶劑中也可能導致熒光強度降低[26]。類似的現象在Liu等[27]的研究中也有報道,其發現用10%～40%的乙醇處理大豆β-伴球蛋白可以使其熒光強度增加,但當乙醇濃度繼續增加會發生熒光淬滅現象。此外,最大發射波長(λmax)可以作為表示Trp微環境的重要指標[24],處理組與對照組的λmax均大于330 nm,說明Trp殘基位于WPI分子外部的極性環境當中[28-29]。當乙醇濃度高于10%時,乙醇改性處理改變了蛋白質中Trp殘基所處的微觀環境,使其趨向極性更強的環境,因此λmax均顯著紅移(P<0.05),且乙醇濃度為50%時紅移最為顯著,由開始的331.40 nm紅移至334.27 nm(P<0.05)[15]。

圖3 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白的內源性熒光光譜的影響

表1 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白的最大發射波長的影響

2.4 紫外吸收光譜

圖4 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白的紫外吸收光譜的影響

蛋白分子中生色基團的分布以及溶液微環境的不同均會影響其紫外吸收光譜。通常,色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)的最大吸收峰在波長275～280 nm處,苯丙氨酸(Phe)的最大吸收峰在波長257 nm處,因此紫外吸收光譜的變化可以反映出蛋白質構象的變化[30]。如圖4所示為不同WPI的紫外吸收光譜圖,從圖中可以看出,對照組在280 nm左右出現最大吸收峰,說明對WPI紫外吸收強度造成影響的是以Trp和Tyr殘基為主。與對照組相比,乙醇改性處理沒有對WPI的最大吸收峰產生顯著影響,但不同乙醇濃度改性處理的WPI最大吸收峰強度均明顯高于對照組,且隨著乙醇濃度的增加,WPI最大吸收峰強度先增加后降低,乙醇濃度為50%時達到最大,這可能是因為經乙醇改性處理的WPI發生去折疊現象,結構變得疏松,有更多的Trp和Tyr殘基暴露出來,使得WPI紫外吸收強度增加,但當乙醇濃度大于50%時,蛋白分子的氨基酸殘基發生重組,導致生色基團被包埋在分子內部,紫外吸收強度減弱[31],該結果與內源性熒光光譜分析結果相一致。

表2 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白的最大紫外吸收波長的影響

2.5 微觀形貌

利用原子力顯微鏡可以在空氣環境中觀察蛋白質的分散和聚集等形態[32]。如圖5、表3所示為通過Nanoscope軟件分析得到的不同樣品的二維圖像(圖5A)、三維圖像(圖5B)和Rq值(表3),B圖為A圖對應的三維圖像,Rq表示蛋白的平均粗糙度,通過它們可以對WPI的表面形態進行一定表征。從A圖和B圖中可以直觀地看出:與對照組相比,處理組的表觀形態均發生變化,表面平滑度降低,顆粒明顯,且乙醇濃度為50%時,粒徑更小且分布更為均勻密集,當乙醇濃度高于50%時,蛋白相互聚集蛋白形成了聚集體,明顯觀察到了大顆粒聚集物。此外,Rq作為微觀形貌的量化指標,可以評價蛋白表面形態水平,當乙醇濃度為10%時,處理組的粗糙度增加了15.8%,但與對照組差異不顯著(P>0.05),當乙醇濃度大于10%時,由于蛋白結構展開程度增加,處理組的Rq值均顯著增加(P<0.05),且乙醇濃度為50%時,Rq值達到最大值0.794 nm,當乙醇濃度大于50%時,Rq開始減小但仍顯著高于對照組(P<0.05),根據任曉鋒等[33]研究結果可知,蛋白質的表面粗糙增加,則蛋白質的分子表面積增大,可以暴露出更多的功能基團,對于改善其功能特性有積極作用。

圖5 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白的微觀形貌的影響

表3 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白表面平均粗糙度的影響

2.6 粒徑和ζ-電勢

蛋白質的聚集程度可以用平均粒徑來表示,而蛋白質的ζ-電勢可以表征體系的穩定性以及粒子表面帶電荷性質,與蛋白質的平均粒徑也密切聯系。從圖6可以看出,處理前后的蛋白分子表面均帶負電荷,表明WPI表面所帶負電荷多于正電荷,隨著乙醇濃度的增加,蛋白結構逐漸展開,有更多的帶電基團暴露出來,分子表面所帶電荷增加,分子間靜電斥力增加,因此蛋白平均粒徑減小,當乙醇濃度增加到30%,粒徑達到最小,乙醇濃度為50%時,蛋白平均粒徑與30%時無顯著差異(P>0.05)。但當乙醇濃度繼續增加到70%,分子表面帶電量減小,靜電斥力降低導致蛋白分子相互靠近并發生相互作用生成聚合物,因此平均粒徑顯著增加(P<0.05)。這種高濃度乙醇條件下發生的聚集可以從蛋白的微觀形貌(AFM)中明顯觀察得到。

圖6 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白粒徑和ζ-電勢的影響

2.7 表面疏水性

蛋白質具有兩親性,其疏水基團通常埋藏在蛋白分子內部,通過改變蛋白分子構象可以使疏水基團暴露,疏水相互作用對于蛋白質的穩定和功能特性至關重要[34]。如表 4所示為不同濃度乙醇改性處理過的WPI表面疏水性的測試結果。從表4中可以看出,與對照組相比,處理組的表面疏水性均顯著增加(P<0.05),且隨著乙醇濃度的增加,WPI表面疏水性呈現先增加后降低的趨勢,當乙醇濃度為50%時處理組的表面疏水性最強,高達8493.00,說明適當濃度的乙醇可以使蛋白質構象改變,蛋白質分子結構展開,埋藏在內部的疏水性氨基酸(如Trp和Tyr)殘基暴露,增加了熒光探針(ANS)的結合位點,使得蛋白質疏水性增強,但當乙醇濃度超過50%時,過高的乙醇濃度可能會破壞蛋白的疏水區域,而且蛋白分子表面暴露的疏水基團之間可能通過相互作用形成疏水聚集體,將部分疏水基團掩蓋,導致蛋白質的表面疏水性降低。類似地,Kundu等[12]在研究乙醇對球蛋白結構的影響時也發現,在適當濃度乙醇的存在下,蛋白質疏水性相對較高的部分被暴露出來,并指出這可能是由于蛋白質表面周圍的電荷密度發生了變化,也可能是由于蛋白分子之間的相互作用發生改變。

表4 不同濃度乙醇改性處理對乳清分離蛋白表面疏水性、EAI和ESI的影響

2.8 乳化特性

蛋白質的乳化特性通常采用EAI和ESI進行表征。EAI指單位質量的蛋白質可以吸附脂肪球的區域面積,ESI表示蛋白質維持油水界面穩定性的能力[35]。從表 4可以看出,各樣品之間ESI與EAI趨勢一致,處理組的EAI和ESI均顯著高于對照組(P<0.05),且隨著乙醇濃度的增加,呈現先增加后降低的趨勢,轉折點出現在50%處,此時EAI和ESI均達到最高,分別為64.48 m2/g和71.10%。結合之前對于蛋白質結構變化的分析可以知道,一定濃度的乙醇可以將WPI結構打開,使暴露的疏水基團數目增加,更多的蛋白分子吸附到油-水界面,更有利于阻止液滴間的相互碰撞和聚集,因此WPI乳化性能有所提高,但當乙醇濃度持續增加時,生成的蛋白聚合物將部分疏水基團掩蓋,導致乳化活力降低,而粒徑較大的蛋白聚合物可能無法有效地覆蓋脂肪滴,導致乳狀液不穩定。Peng等[15]研究發現,低濃度乙醇改性處理β-伴球蛋白可以增強其表面疏水性,顯著提高其乳化性能和界面穩定性,與本研究結果相一致。

3 結論

本實驗主要針對利用不同濃度的乙醇誘導改性是否能夠打開WPI分子結構以及改善其乳化特性進行了深入研究。研究結果發現,乙醇改性能夠促使分子結構的展開和重排,使WPI分子表面暴露出更多疏水基團并增加分子表面平均粗糙度。同時,高濃度乙醇使WPI分子部分發生變性還會產生蛋白質聚集。基于結構的改變,WPI的EAI和ESI得到了顯著的提升,尤其是乙醇濃度為50%時改善效果最為顯著。因此,本實驗為改善WPI的乳化特性提供了有效的策略。