代謝組學在胰腺外分泌疾病中的研究進展

唐曦平

廣西醫科大學附屬腫瘤醫院內鏡中心，南寧 530021

【提要】 胰腺疾病可導致機體出現嚴重的代謝紊亂，而反映生物信息終端事件的代謝組學研究則能夠系統、全面地體現疾病狀態下機體發生的變化。因此，應用代謝組學技術研究胰腺外分泌疾病的發病機制，有助于疾病的早期診斷及治療。

代謝組學(metabolomics 或metabonomics)是后基因組時代發展起來的一門新興的組學技術，最早于20世紀末由Nicholson等[1]和Fiehn等[2]相繼提出，其與基因組學、轉錄組學、蛋白質組學共同構成系統生物學整體。代謝組學的具體定義是指定量測定生物系統對病理生理刺激以及基因改變產生的多參數代謝的動態應答，分析對象是細胞、組織或器官中低分子量(50～2 000)代謝產物的集合[3-4]。由于代謝產物處于生物信息傳遞的終端，反映的是已經發生了的生物學事件，基因表達和蛋白質的變化對系統產生的影響都可在代謝物水平上得到體現，因此代謝組學強調的是機體整體的變化，是所有代謝應答的全貌和動態變化的過程。與基因組學和蛋白組學相比，代謝組學不僅更能表現出生物體系整體功能或狀態的最終結果，并且放大了基因和蛋白表達的微小變化，從而使檢測更容易；研究不需進行全基因組測序或建立大量表達序列標簽的數據庫；代謝產物的種類遠少于基因和蛋白質的數目，且代謝產物在各個生物體系中都是相似的，研究中采用的技術更通用[5]。代謝組學的基本研究方法是通過高通量高分辨率的檢測技術，對代謝產物進行測定，得到海量數據集，再通過數據分析得到有差異的代謝物質，并尋找其代謝通路，解釋其生物學意義。

一、代謝組學技術

目前代謝組學技術應用最廣泛的是核磁共振技術(nuclear magnetic resonance，NMR)、色譜法和質譜法及其聯用技術，包括氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)和液相色譜-質譜(liquid chromatograph-mass spectrometer, LC-MS)。

1．NMR：NMR是代謝組學的常用檢測技術之一，特別是1H-NMR。其優點是樣品前處理簡單，樣品用量少，無損傷性，無偏向性，對所有化合物的靈敏度一樣，能完成代謝產物中大多數化合物的檢測。但其缺點是靈敏度、分辨率較低，不適用于大量低豐度代謝物的分析。近年13C-NMR的應用提高了其分辨率[6]，進一步拓寬了NMR 技術的應用領域，廣泛應用于藥物毒性、生理病理過程機制研究以及疾病的臨床診斷。

2．色譜-質譜聯用技術：與NMR相比，色譜-質譜聯用技術具有較高的靈敏度和專屬性，可以實現對多個化合物的同時快速分析與鑒定，兼備色譜的高分離度、高通量及質譜的普適性、高靈敏度和特異度等特點，具有檢測分離模式多樣、變量與代謝物直接相關等優勢，逐漸成為代謝組學研究中最主要的分析工具之一。(1) GC-MS技術：GC的高效分離結合MS的結構鑒定功能，使GC-MS具有高精密度、高靈敏度及經久耐用性[7]，可以同時測定幾百個化學性質不同的化合物。與LC-MS相比，GC-MS的優勢在于可以從標準譜圖庫中獲得化合物結構信息，對代謝物易于定性，適合對揮發性物質的研究；缺點是樣品需做衍生化處理才能得到較多的代謝組分信息[8]，從而使得樣本前處理過程不僅復雜繁瑣，可能也會導致某些物質信號的丟失。(2)LC-MS技術：相對于GC-MS，LC-MS能分析更高極性和更高相對分子質量的化合物，主要應用于臨床疾病診斷、部分疾病生物標志物的發現等，并可通過對代謝物結構的鑒定，對樣本進行針對性和細致的分析，非常適合于生物樣本中復雜代謝產物的檢測和潛在標志物的鑒定，已被越來越多地用于代謝組學研究[9-10]。尤其是超高效液相色譜(ultra performance liquid chromato-graphy，UPLC)技術的樣品前處理簡單，對待測組分的揮發性和熱穩定性沒有要求，不需繁瑣的衍生化步驟，可進行快速高效的檢測[11]。其缺點是缺少可以參考的標準譜圖數據庫，代謝物鑒定需借助標準品，鑒別相對困難。但LC-MS 雖然缺少可以參考的標準譜圖數據庫，卻可以通過它獲得代謝物精確的分子質量數，再通過數據庫進行檢測確定分子的結構信息[12]。

3．多種分析平臺的聯合應用：代謝物本身具有多樣性與復雜性的特點，而每種分析平臺都存在自身的局限性，目前并沒有一個單一的技術可以同時測定和識別樣品中所有的代謝物，所以需綜合各分析平臺的數據以得到更全面的代謝物信息[13]。例如，為了覆蓋更廣泛的代謝物，Naz等[14]首次將多種互補分析技術成功應用于患有敗血癥的大鼠肺組織，并且證明了在代謝組學研究和生物標志物發現中應用多平臺方法的重要性。Jung等[15]應用NMR和UPLC-MS 相結合的分析方法分別測定了兩種不同處理方式的黃芪根樣本，結果顯示去皮根的某些主要代謝物顯著損失，表明該技術為中藥材采收及處理后評估分析有效成分提供有力工具。Ibanez等[16]運用多平臺分析技術研究膳食多酚對人類結腸癌細胞的抗增殖作用，發現多酚類代謝產物呈現顯著差異，同時證明了這種多分析平臺由于其互補性質而提供了廣泛的代謝信息和覆蓋范圍。因此，將多種分析技術的代謝組學數據進行整合，既可提供更全面的代謝物輪廓信息，使結果更完善，也使不同分析技術的結果得到互相驗證，達到分析平臺優勢互補[17]。

二、代謝組學在胰腺外分泌疾病中的相關研究

胰腺是重要的消化器官，與蛋白質、糖類、氨基酸、脂類代謝密切相關，一旦胰腺發生疾病，會引起人體營養物質代謝嚴重紊亂。因此，應用代謝組學技術研究胰腺疾病的發病機制，有利于實現早期診斷或進行藥物療效觀察。

1．代謝組學在AP中的相關研究：AP是消化內科常見疾病，起病急，如不及時干預治療，常發生SIRS，從而引發高分解代謝狀態，導致能量需求和蛋白質分解代謝增加[18]，因此AP患者伴有嚴重的代謝紊亂，而代謝紊亂狀況會進一步擾亂氨基酸、葡萄糖和脂質代謝，從而導致組織和器官損傷的并發癥。動物實驗表明即使在組織損傷發生之前，胰腺炎癥的存在也會引起代謝物(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脂質和牛磺酸)水平的改變，因此檢測代謝物水平有助于更好地了解患者病理生理狀況，從而有助于早期診斷疾病[19]。不同的代謝組學技術應用于檢測大鼠AP模型尿液[20]、小鼠高脂血癥性AP模型血清[21]，表明模型構建后血尿中代謝物的主要成分發生了變化；高分辨液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用技術被應用于中藥治療前后AP模型大鼠血清的研究，發現了一些顯著差異的可能生物標志物，包括甘油、谷氨酸、低密度脂蛋白、飽和脂肪酸、丙氨酸和谷氨酸酰胺等[22-23]。在臨床研究中，GC-MS被用于檢測AP患者血清并確定了一些潛在生物標志物[24]；應用超高效液相色譜-高分辨率質譜(ultra performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry, UPLC-HRMS)分析顯示8種代謝產物(鞘氨醇、辛酰膽堿、甘氨膽酸、肉豆蔻酸、癸酰膽堿、十二烷醇、2-十四烷酮和L-甲狀腺素)在MAP患者血清中明顯增高，且其中4種還可隨著病情好轉而下降，從而可用作病情變化的動態監測指標[25]；Villasen等[26]應用NMR同時分析AP患者尿液和血漿的代謝表型，證實由鳥嘌呤、馬尿酸或肌酸(尿液)以及纈氨酸、丙氨酸、脂蛋白(血漿)組成的組合生物標志物在AP中具有很強的診斷和預后潛力。以上研究表明，代謝組學在AP中的新發現，尤其是氨基酸與脂類代謝的變化為未來AP機制的研究提供了可能方向。

2．代謝組學在胰腺癌和CP中的相關研究：胰腺癌是癌癥相關死亡的第四大常見原因，5年生存率<5%[27]。由于診斷延遲和治療方案進展緩慢，預計到2030年胰腺癌將成為癌癥相關死亡的第三大原因[28]。其致死性可歸因于晚期診斷以及對常規放、化療的幾乎完全抵抗性，因此為了能夠早期診斷胰腺癌，對可靠診斷生物標志物的研究和定義仍然是一個受到極大關注的主題。胰腺腫瘤細胞的生長可以引起胰腺內外分泌功能異常，導致機體能量、脂肪及氨基酸代謝狀態的改變，同時為適應腫瘤組織引起的代謝異常，機體又出現一定的代償，最終引起血液、尿液及組織在代謝組分上的改變。通常在癌變過程中，基因和代謝物的異常變化都先于組織形態變化的發生，因此檢測這些異常變化將有助于腫瘤的早期診斷。迄今為止，國內外已開展了多項關于代謝組學與胰腺癌的研究。Michálková等[29]通過應用1H-NMR光譜對胰腺癌患者和健康對照者的血漿樣品進行檢測，研究胰腺癌誘導的代謝變化，結果提示，3-羥基丁酸鹽和乳酸鹽的水平差異有統計學意義，該結果(100%靈敏度，90%特異度)清楚地顯示了1H-NMR光譜在胰腺癌診斷中的潛力。Schmahl等[30]應用NMR光譜比較5、11、15月齡的對照組及胰腺癌組小鼠尿液、血清、糞便提取物和胰腺組織提取物的代謝特征，檢測胰腺癌的癌前胰腺上皮內瘤變，確定了潛在的生物標志物(尿液：3-吲哚氧基硫酸鹽、苯甲酸鹽和檸檬酸鹽減少；血液：葡萄糖、膽堿、乳酸鹽、苯丙氨酸和苯甲酸鹽減少；糞便：乙偶姻增加)。Shu等[31]對226例胰腺癌患者及其匹配的健康對照者搜索胰腺癌風險的循環代謝生物標志物，確定了4種與胰腺癌相關的代謝物，并且進一步表明甘油磷脂的失調可能在胰腺癌發展中起重要作用。

CP是胰腺癌的高風險因素，約5%的CP患者發展為胰腺癌[32-33]，但兩者均以過度反應性的基質或結締組織為特征。在影像學的診斷過程中兩者經常相互混淆，給疾病的鑒別和診斷帶來了很大困難。代謝組學為尋找早期區分二者的非侵入性診斷性標志物開拓了更廣闊的前景。在一項大規模研究中，包括271例胰腺癌和282例CP在內的914例受試者的血清和血漿經過LC-MS和GC-MS檢測與驗證分析，確定了29個代謝產物在CP和胰腺癌之間存在明顯差異，且預測CP患者中胰腺癌的發生率可以達到1.95%，其優化預測值達到99.9%[34-35]。Lindahl等[36]使用基于LC-MS的代謝組學發現甘氨膽酸、N-棕櫚酰谷氨酸和己酰基肉堿3種單一代謝產物以及加上苯乙酰谷氨酰胺、鵝去氧甘構成的一個5種代謝物組合在兩個獨立的隊列中可以作為區分CP和胰腺癌的標志物。

三、結語

AP、CP及胰腺癌發病率逐年提高、胰腺癌早期診斷方法有限、CP與胰腺癌鑒別困難以及這些胰腺外分泌疾病與機體代謝改變關系密切等因素，使代謝組學在胰腺疾病中的研究成為勢不可擋的新方向。代謝組學作為一種新興的系統生物學技術，因其簡便無創、高通量、高精確性及高靈敏度的特點而迅速成為多學科、多領域研究的熱點，近年在胰腺疾病的研究中也有了一些新的進展，但目前仍然具有一些不足之處，例如分析技術還不夠成熟、不同檢測分析技術的缺陷、收集的生物信息量過于龐大、數據建模和挖掘不充分等。隨著多種技術的進一步革新發展，更高通量、高靈敏度的檢測技術與更高效的數據分析方法的整合應用，以及代謝組學與各組學技術的聯用等，相信代謝組學技術在胰腺外分泌疾病的診斷、發生發展機制及治療中的應用將會有突破性的進展。

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