浮萍原生質體瞬時表達體系的建立及其應用研究

宋樂元，方 揚，田 潤，杜安平，王海燕*

(1.四川大學生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 610065；2.中國科學院成都生物研究所，中國科學院環境與應用微生物重點實驗室,四川 成都 610041；3.四川維度創研生物科技有限公司，四川 成都 610041)

【研究意義】浮萍是一種形態極其簡單的小型開花植物[1]，其組織形態高度退化為“葉狀體”，但部分品種仍有“根莖葉花果實”的分化，具有高等植物同樣的復雜表達系統[2]。浮萍生長速度極快，培養簡單且成本低廉，也可無性繁殖。這不僅有利于遺傳穩定性，還使其生物反應器不受季節限制，可以實現連續生產?！厩叭搜芯窟M展】目前，研究者已對部分浮萍品系開展了遺傳轉化體系的研究，有2個品系的表達體系已經用于商業化生產抗體、藥用蛋白、人源化重組蛋白、生長素、生長因子等[3]。浮萍的生物學特征以及現有的研究基礎均表明其表達體系是一個極具潛力的植物表達體系，在生物反應器領域有廣闊的應用前景。因此，浮萍生物反應器的開發受到越來多的研究者的青睞，而浮萍遺傳轉化體系的研究、植物表達系統所需的功能元件的挖掘和篩選鑒定等工作，就成了浮萍生物反應器開發的核心問題?！颈狙芯壳腥朦c】植物遺傳轉化操作通常需要較長的周期，這也是浮萍生物反應器開發的主要限速步驟。而浮萍的瞬時表達體系正適合浮萍生物反應器的快速研究，包括對功能元件的挖掘和篩選以及植物表達體系的優化等。然而，目前尚未見關于浮萍瞬時表達體系研究的報道。傳統的植物原生質體瞬時表達體系是利用電轉化和化學轉化等方式將外源基因導入原生質體，經過夜培養即可。但是，在前期實驗中發現浮萍原生質體比較脆弱，難以經受轉化及較長時間的放置，故選擇以農桿菌浸染愈傷作為外源基因轉入方式，再將轉化細胞制備原生質體?！緮M解決的關鍵問題】因此，本研究擬通過優化調整農桿菌浸染和浮萍原生質體制備的相關實驗參數，建立浮萍瞬時表達體系，并對其應用進行初步探索，為浮萍生物反應器的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

浮萍Lemnagibba愈傷組織、載體pCAMBIA2300-GFP和pCAMBIA2301-U啟-GFP均來自中國科學院成都生物研究所；載體pCAMBIA2301和pCAMBIA2301-N啟-GFP由四川維度創研生物科技有限公司提供；農桿菌GV3101、LBA4404、C58C1及EHA105購自武漢淼靈生物科技有限公司。

1.2 試劑

MgCl2、CaCl2、KCl2。MES、甘露醇、BSA購自sigma；果膠酶(Pectolyase Y-23)、纖維素酶(Cellulase R-10)和離析酶(Macerozyme R-10)購自Yakult；pMDTM19-T Vector Cloning Kit、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、TaKaRa ExTaq?、限制性內切酶購自TAKARA；T4DNA ligase、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo Fisher；Eastep?Super Total RNA Extraction Kit購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 擬南芥基因擴增 提取擬南芥總RNA(Eastep?Super Total RNA Extraction Kit)利用反轉錄技術獲取cDNA(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，然后以其為模板，分別擴增基因AT3G10030.1(Aspartate/glutamate/uridylate kinase family protein)和AT2G26800.2(Aldolase superfamily protein)(表1)。基因AT4G16410.1(Transmembrane protein)直接合成N端198 bp，并在兩端分別添加EcoRⅠ和BglⅡ。

1.3.2 載體構建 將載體pCAMBIA2301用XhoⅠ酶切后自連，構成載體pCAMBIA2301-a。再以載體pCAMBIA2300-GFP為模板，依次用上游引物MCS-gfp3、MCS-gfp2、MCS-gfp1與下游引物YS009搭配，采用重疊PCR技術擴增帶有多克隆位點的GFP(Green Fluorescent Protein )序列，并將其連接到pCAMBIA2301-a之中，替換原GUS基因，構成載體pCAMBIA2301-GFP-MCS。最后將該載體用PvuⅡ酶切后自連，構成載體pCAMBIA2301-GFP。

將擬南芥基因AT3G10030.1經NcoⅠ和BamHⅠ插入載體pCAMBIA2301-GFP，融合于GFP的N端，構成載體pCAMBIA2301-C-GFP(用于胞質定位研究)；將擬南芥基因AT2G26800.2經NcoⅠ和BglⅡ插入載體pCAMBIA2301-GFP，融合于GFP的N端，構成載體pCAMBIA2301-M-GFP(用于膜定位研究)；將擬南芥基因AT4G16410.1經EcoRⅠ和BglⅡ插入載體pCAMBIA2301-GFP，融合于GFP的N端，構成載體pCAMBIA2301-CH-GFP(用于葉綠體定位研究)。

表1 引物信息

圖1 植物載體Fig.1 Representation of plant-compatible vectors

1.3.3 原生質體產率測定 將潔凈的血球計數板覆上蓋玻片，取原生質體溶液滴入血球計數板與載玻片的縫隙，待液體充滿計數室后，在顯微鏡下觀察并記錄計數室的原生質體數量，重復3次。

原生質體產率(個/g)=計數室原生質數量×稀釋倍數×10 000(個/mL)×體積(mL)/初始質量(g)

1.3.4 原生質體活性測定 制備原生質體單細胞懸液，按2∶1的比例加入FDA染液[4]染色1～2 min，取少量于載玻片上觀察，發熒光者即為活細胞。

熒光顯微鏡觀察方法：采用450～490 nm激發濾片，510 nm雙分色鏡和520 nm阻擋濾片的FITC濾片組進行觀察并記數，重復3次。

細胞活率(%)= 活細胞總數/總細胞數×100

1.3.5 浮萍原生質體制備參數優化 本研究采用酶解法制備浮萍原生質體，根據文獻報道[5-9]及前期實驗結果，酶解液為2 %纖維素酶、0.5 %離析酶、0.5 %果膠酶、20 mmol/L MES、0.5 mol/L甘露醇、20 mmol/L KCl、10 mmol/L CaCl2、0.1 % BSA、pH 5.8。分別對制備材料類型、預處理方法、滲透壓濃度進行單因素試驗。

其中，材料類型分別為綠色致密型愈傷(Lemnagibba愈傷誘導時，葉片卷曲膨大，最早出現的綠色顆粒狀愈傷組織)、黃色松散型愈傷(綠色致密型愈傷繼續培養后，出現的黃色松散似沙狀的愈傷組織)和懸浮培養愈傷(利用黃色松散型愈傷組織進行懸浮培養，待其愈傷顆粒大小約3 mm即可)；滲透壓濃度為0.2～0.7 mol/L的甘露醇；預處理方法分別為未處理、暗處理(暗培養16 h)、冷處理(4 ℃放置16 h)、高滲處理(0.6 mol/L甘露醇浸泡30 min)、復合處理Ⅰ(暗培養16 h，再用0.6 mol/L甘露醇浸泡30 min)、復合處理Ⅱ(4 ℃放置16 h，再用0.6 mol/L甘露醇浸泡30 min)。

制備方法：取制備材料0.2 g，加入2 mL酶解液，置于26 ℃環境中避光振蕩(40 r/min)孵育12 h。加入2 mL W5溶液[8]輕柔混勻，經200目鋼絲網過濾，1000 r/min離心3 min，小心去掉上清，用200 μl MMG溶液(4 mmol/L MES、0.5 mol/L甘露醇、15 mmol/L MgCl2、pH 5.8)輕輕重懸細胞。各組試驗均重復3次，統計原生質體產率和活性。

1.3.6 農桿菌浸染參數優化 本研究分別對農桿菌類型、菌液濃度、乙酰丁香酮濃度及共培養時間等因素進行單因素試驗。除試驗因素外，其余因素參照下述浸染方法。

浸染方法：①將農桿菌培養至OD600約為1，于3000 r/min離心10 min收集菌體，用等量B5培養基(含100 μmol/L乙酰丁香酮)重懸菌體即為浸染液。②選取生長狀態較好的懸浮培養愈傷組織1 g(鮮重)，加入10 mL浸染液，靜置20 min，吸干菌液。③將浸染后的愈傷組織轉移到鋪墊有濾紙的培養皿中，加入2～3 mL B5培養基(含100 μmol/L乙酰丁香酮)，保持濾紙和愈傷組織濕潤，于28 ℃暗培養2 d。④用清水沖洗愈傷組織去除殘留農桿菌，制備原生質體并用熒光顯微鏡觀察。取50 μl原生質體溶液統計轉化率，并重復3次。

轉化率(%)=發光細胞數/總細胞數×100

1.3.7 浮萍原生質體亞細胞定位 根據文獻報道[10-11]選擇定位于細胞膜(AT2G26800.2)、細胞質(AT3G10030.1)和葉綠體(AT4G16410.1)的擬南芥基因，分別與GFP構成融合表達載體，利用浮萍瞬時表達體系進行瞬時表達，通過共聚焦顯微鏡(Leica TCS-sp8)觀察其在浮萍細胞中的定位情況。

GFP觀察的激光參數：激發光488 nm，發射光：505～530 nm；葉綠體自發光的激光參數：激發光488 nm，發射光600～750 nm。

1.3.8 啟動子功能檢測 選取3個用于植物細胞蛋白表達的啟動子：35 S啟動子、N啟動子、U啟動子。以GFP作為報告基因，利用浮萍原生質體進行瞬時表達，并用熒光顯微鏡(Nikon Ti-E)觀察GFP表達情況。采用Image J軟件統計500個發光細胞的累積光密度，并用NORMDIST函數分析其分布情況。

2 結果與分析

2.1 材料類型對原生質體制備產率和活性的影響

浮萍Lemnagibba制備原生質體時，不同類型的愈傷組織制備原生質體的產率差異極顯著，而活性差異卻不顯著(表2)。其中，以懸浮培養的愈傷組織制備原生質體的產率最高，故以其作為制備原生質體的材料。

2.2 滲透壓濃度對原生質體制備產率和活性的影響

滲透壓濃度對浮萍Lemnagibba原生質體制備的影響主要在產率方面。當甘露醇濃度在0.2～0.6 mol/L時，原生質體的活性差異不顯著，但濃度上升到0.7 mol/L時，活性下降極顯著。隨著滲透壓的增加，原生質體的產率先增后減，當甘露醇濃度為0.5 mol/L時，產率達到最高水平，且與其他濃度相比，差異達到極顯著水平(表3)。綜合考慮產率和活性情況，選擇滲透壓條件為0.5 mol/L甘露醇。

2.3 預處理方法對原生質體制備產率和活性的影響

經過冷處理的材料，其制備的原生質體的活性相對較高，且差異顯著性達到極顯著水平。在原生質體產率方面，冷處理僅低于暗處理，且差異不顯著，卻與其他處理方法的差異顯著(表4)，故選擇冷處理作為預處理的方法。綜合上述試驗，浮萍Lemnagibba的懸浮培養愈傷組織(圖2-a)，可以用酶解法來制備原生質體(圖2-b)，并可用FDA染色來檢測活性情況(圖2-c)。

2.4 農桿菌浸染參數對轉化率的影響

本研究所選的4種農桿菌，在浸染浮萍Lemnagibba愈傷組織時，其轉化率的差異極大，其中GV3101轉化率最高(圖3-a)。轉化率隨著農桿菌GV3101濃度的增加，呈現先升后降的趨勢。當其濃度(OD600)為1時，轉化率最高(圖3-b)。而乙酰丁香酮濃度為100 μmol/L時，轉化率最高，過高和過低的乙酰丁香酮都會降低轉化效率(圖3-c)。在缺乏乙酰丁香酮時，未能成功轉化，可見其對于浮萍Lemnagibba是必須的。另外，在一定時間內，增加共培養的時間有利于農桿菌浸染更加充分，進而增加轉化率。當共培養2～3 d時，具有最高的轉化率，而隨著時間繼續延長，轉化率又開始下降，這可能是由于愈傷生長狀態下降所致(圖3-d)。因此，兼顧轉化率和實驗周期，共培養時間為2 d。

表2 不同材料制備原生質體活性和產率的差異顯著性(LSD法)

表3 不同滲透壓條件制備原生質體產率和活性的差異顯著性(LSD法)

表4 不同預處理條件制備原生質體活性和產率的差異顯著性(LSD法)

a：懸浮培養愈傷組織；b：原生質體；c：原生質體FDA染色(發光者皆為活細胞)圖2 原生質體制備及活性測定Fig.2 Preparation and activity determination of protoplasm

圖3 農桿菌浸染參數對轉化率的影響Fig.3 The impacts of conditions of agrobacterium tumester on transformation rate

2.5 亞細胞定位

本研究共選擇3個已知定位信息的擬南芥基因，并以GFP作為報告基因。其共聚焦顯微鏡觀察結果(圖4)顯示，GFP基因單獨表達時，其熒光分布于整個細胞質中。擬南芥基因AT3G10030.1與GFP融合表達時，熒光分布于整個細胞質，與其在擬南芥細胞中定位情況一致[10]。擬南芥基因AT2G26800.2與GFP融合表達時，熒光主要分布于細胞膜，與其在擬南芥細胞中定位基本一致[10]。擬南芥基因AT4G16410.1與GFP融合表達時，熒光分布位置與葉綠體自發光位置一致，與其在擬南芥中的分布情況基本一致[11]。上述結果表明，該瞬時表達體系可以用來研究目的蛋白的亞細胞定位情況。

C：細胞質 M：細胞膜 CH：葉綠體 ;*標尺：10 μm圖4 亞細胞定位結果Fig.4 The results of subcellular localization

2.6 啟動子功能檢測

本研究選取3個植物啟動子分別與GFP構建融合表達載體，并利用浮萍原生質體瞬時表達體系進行瞬時表達。結果表明，不同啟動子的發光強度有所差異(圖5-a)，且同一表達載體在不同細胞中的表達情況也不相同。對500個發光細胞的統計分析，3個啟動子表達GFP累計光密度分布顯示：U啟動子累積光密度的總體平均數最大(49.60)，N啟動子次之(43.13)，35S啟動子最小(18.65)；而離散度則是N啟動子最大，U啟動子次之，35S啟動子最小(圖5-b)。

3 討 論

植物原生質體制備的方法包括機械法、滲透壓法和酶解法，酶解法是目前最常用的方法，其中常用的酶有纖維素酶、離析酶、果膠酶、半纖維素酶和崩潰酶等[12]。本研究采用纖維素酶、離析酶和果膠酶制備浮萍的原生質體，經過對原生質體制備材料、預處理方法、滲透壓濃度等一系列參數的優化，確定了浮萍Lemnagibba原生質體制備的最佳方案：以4 ℃過夜培養的浮萍懸浮培養愈傷組織為制備材料，用酶液(2 %纖維素酶、0.5 %離析酶、0.5 %果膠酶、0.1 mol/L CaCl2、0.2 mol/L KCl、1 % BSA、20 mmol/L MES pH 5.8、0.5 mol/L甘露醇)于25 ℃避光消化16 h(40 r/min)。

a：不同熒光強度的原生質體細胞；b：不同發光細胞的累積光密度分布情況圖5 GFP發光情況及其累積光密度分布情況Fig.5 GFP luminescence and its cumulative optical density distribution

農桿菌浸染浮萍Lemnagibba愈傷組織的效率受到諸多因素的影響，包括愈傷組織的生長狀態、農桿菌的類型及濃度、乙酰丁香酮濃度和共培養的時間等[13]。其中農桿菌的類型影響極大，GV3101在OD600≈1、乙酰丁香酮100 μmol/L時，轉化效率最佳。此外，愈傷組織的生長狀態也很重要，但難以對其生長狀態進行準確的界定，需要一定的經驗積累。而共培養時間的延長可以增加農桿菌持續浸染時間，但也會逐漸降低愈傷組織活性。

蛋白質的亞細胞定位研究有助于探索其生理功能，是當前蛋白質組學研究的一個重要方法，也常用于生物信息學預測信息的驗證[14]。而GFP以其極好的靈敏性和無細胞毒性，可實現對活體的實時觀察，被廣泛用作定位研究的報告基因[15]。本研究將擬南芥中已知定位信息的基因，與GFP構建融合表達載體，利用浮萍原生質體瞬時表達體系進行瞬時表達，證明該體系可以用于亞細胞定位研究。這為浮萍基因的亞細胞定位研究奠定了基礎，可以在一定程度上避免使用擬南芥等模式植物進行研究的物種差異[16]。

高效的表達載體是生物反應器開發和利用不可或缺的，而啟動子則是一個高效表達載體所必須的核心元件?？焖贉蚀_地檢測啟動子的功能，方能為構建高效的表達載體提供堅實基礎。通常而言，需經過轉基因操作獲取轉基因植株，再通過分析目的基因表達情況來評估啟動子的功能，這樣獲得的結果雖最為準確，但卻需要耗費長達數月甚至數年時間，且難以實現高通量。利用浮萍Lemnagibba瞬時表達體系，可以快速地檢測載體的表達情況，從而評估包括啟動子在內的表達載體功能元件的功能。然而，該瞬時表達體系對于組織特異性啟動子功能的驗證還存在不足，需要更加深入的研究。另外，該瞬時表達體系不僅耗時短，大約3～4 d，還可以實現高通量檢測，大大提高了實驗效率。本研究選擇的3個啟動子表達GFP的熒光強度存在差異，主要表現在總體平均數、離散度等方面，證明該方法可用于驗證啟動子功能。但是，該結果并不界定啟動子的強弱，僅展示其熒光強度的分布情況。故，在具體的研究中，應根據研究目的不同，以總體平均數或離散度作為標準，選擇恰當的啟動子。

與模式植物擬南芥的原生質體瞬時表達體系相比，以農桿菌介導的浮萍Lemnagibba瞬時表達體系還存在一定的差距，主要體現在轉化率上，尚不足擬南芥的十分之一。該體系較低的轉化率也大大增加了工作量，還限制了該體系的應用領域。然而植物原生質體制備和轉化是極為復雜的，本研究還有一些技術障礙未能突破，需要更加深入的探索。在植物原生質體制備過程中，常用產率和活性來評估其制備方法，但用這種評估標準制備出的原生質體可能并不是最適合轉化的，這也是值得探索的方面。隨著研究的深入，浮萍原生質體瞬時表達體系可更加高效、穩定，為浮萍生物反應器的開發提供助力。

4 結 論

成功建立浮萍原生質體瞬時表達體系，可以在短時間內完成亞細胞定位研究和啟動子功能驗證。