藻藍(lán)蛋白-殼聚糖復(fù)合膜的制備及性能表征

羅愛(ài)國(guó),趙 琪,2,馬建華,楊艷君,胡變芳,*

(1.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山西榆次 030619;2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

隨著消費(fèi)者對(duì)塑料包裝材料安全、環(huán)保問(wèn)題的擔(dān)憂,食品包裝材料的研發(fā)越來(lái)越趨向于可降解活性材料。研究者從動(dòng)物、植物及微生物中提取分離得到多糖、蛋白及脂類(lèi)等物質(zhì)作為可降解包裝材料[1-3]。殼聚糖是甲殼素脫乙酰化的產(chǎn)物,由β-(1-4)-2-乙酰氨基-D-葡萄糖和β-(1-4)-2-氨基-D-葡萄糖組成天然陽(yáng)離子多糖,具有良好的成膜性、生物降解性、機(jī)械性能、選擇滲透性以及一定的抑菌活性[4-5],在食品可降解活性包裝材料領(lǐng)域、保障食品質(zhì)量安全方面具有廣闊應(yīng)用前景。很多研究將各種天然抗菌等活性物質(zhì)添加到膜中制成活性包裝膜,以改善包裝膜的抑菌性、抗氧化性及包裝性能[6-9]。

鈍頂螺旋藻(ArthrospiraplatensisGomont)為多細(xì)胞絲狀藍(lán)藻,易培養(yǎng),產(chǎn)量大,是國(guó)內(nèi)最早三大產(chǎn)業(yè)化藻類(lèi)之一,富含藻藍(lán)蛋白、多糖、黃酮、酚類(lèi)、β-胡蘿卜素和γ-亞麻酸等活性物質(zhì)[10]。藻藍(lán)蛋白的含量占蛋白總量的40%,主要由藻藍(lán)膽素和脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合而成,是一種天然抑菌活性成分,且易溶于水、無(wú)毒。此外,藻藍(lán)蛋白還具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等生理活性[11-13]。藻藍(lán)蛋白能夠抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、鏈球菌等生長(zhǎng)繁殖[14-16],其抑菌譜廣、抑菌作用強(qiáng)。

藻藍(lán)蛋白可作為活性抗菌蛋白添加包裝材料。目前有關(guān)藻類(lèi)活性成分改善包裝膜性能的研究很少。García-Soto等[17]將添加海藻螺旋藻添加到聚乳酸制成環(huán)保型包裝膜,用于魚(yú)類(lèi)保鮮;史建如等[18]將褐藻多酚、殼聚糖及羧甲基纖維素鈉制備成相容性較好、表面致密的可食膜。然而,殼聚糖膜中添加藻類(lèi)蛋白是否有利于改善膜的形態(tài)與結(jié)構(gòu),值得人們研究。此外,復(fù)合膜的透光性能也是需要探索的問(wèn)題之一。前期課題組利用藻類(lèi)活性提取物與殼聚糖復(fù)合成膜,制備抗氧化性更強(qiáng)的復(fù)合可降解膜[19],同時(shí)研究了藻藍(lán)蛋白-殼聚糖復(fù)合膜制備工藝,初步確定了復(fù)合膜比例為殼聚糖2.0%(w/v)、甘油1.0%(w/v)、乙酸為1%(w/v)。本研究將進(jìn)一步考察藻藍(lán)蛋白添加比例對(duì)藻藍(lán)蛋白-殼聚糖復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)特性、光線阻隔性、水蒸氣阻隔性、機(jī)械性能及抑菌性能的影響,探討其作為食品活性包裝膜的潛能。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

鈍頂螺旋藻粉(食用級(jí)) 購(gòu)于浙江一諾生物科技有限公司;殼聚糖(分子量165 kDa,低粘度,脫乙酰度95%) 西安大豐收生物科技有限公司;其他試劑均為分析純;大腸桿菌ATCC 25922 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

EV-2600可見(jiàn)分光光度計(jì) 深圳市鴻永精儀科技有限公司;美國(guó)Nicolet 670傅立葉紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司;蔡司MERLIN Compact掃描電子顯微鏡 德國(guó)卡爾·蔡司股份公司;CMT4204微機(jī)控制電子萬(wàn)能拉力機(jī) 上海恒企精密機(jī)械廠;PERMETM W3/030水蒸氣透過(guò)率測(cè)試儀 濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻藍(lán)蛋白的提取及含量測(cè)定 藻藍(lán)蛋白的提取參照李冰等[20]的方法,并做了部分修改。取鈍頂螺旋藻粉,按料液比1∶20 (g/mL)加入10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.0),經(jīng)高速攪拌0.5 h后,先后在-18和38 ℃溫度條件下靜置24 h,并反復(fù)凍融三次。在7000 r/min下冷凍(4 ℃)離心0.5 h,取上清液,加入硫酸銨(飽和度50%)鹽析24 h沉淀蛋白。得到蛋白沉淀再次用適量的PBS溶解,置于截留分子量為12 kDa的透析袋,在PBS中透析24 h除去銨離子,得藻藍(lán)蛋白(AP)。AP含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法,以標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=0.7504 x+0.0234,R2=0.9954,測(cè)得其含量為59.72%±2.60%。

1.2.2 藻藍(lán)蛋白/殼聚糖可降解活性膜的制備 藻藍(lán)蛋白/殼聚糖復(fù)合膜制備參照Siripatrawan等[21]的方法,并作部分修改。用100 mL 1%的乙酸溶液溶解2 g殼聚糖,并加入1 g甘油,在60 ℃水浴中磁力攪拌30 min(100 r/min),制得殼聚糖膜溶液。將AP溶于殼聚糖膜溶液中配制成濃度為0、0.5%、0.75%和1.0%(w/v)的復(fù)合膜溶液,經(jīng)均質(zhì)、真空脫氣后,在自制成膜器(30 cm×15 cm)上流延成膜,經(jīng)室溫干燥24 h后揭膜,制得單一殼聚糖膜(CH-film)和藻藍(lán)蛋白/殼聚糖復(fù)合膜(AP/CH-film),于25 ℃、相對(duì)濕度50%的干燥器中貯存?zhèn)錅y(cè)。

1.2.3 紅外光譜掃描 采用傅立葉紅外光譜儀進(jìn)行分析,以透射模式進(jìn)行掃描,掃描范圍為4000～500 cm-1,掃描次數(shù)為32次,分辨率為4 cm-1。

1.2.4 微觀結(jié)構(gòu)觀察 將膜樣品裁成5 mm×5 mm方塊,用導(dǎo)電膠固定在銅臺(tái)上,真空噴金后,用掃描電子顯微鏡在5 kV加速電壓下,對(duì)膜樣品的表面和橫截面結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描觀察,平面和截面的放大倍數(shù)分別為1000和5000。

1.2.5 不透明度的測(cè)定 膜不透明度的測(cè)定參照Park等[22]的方法,取樣品膜在UV計(jì)600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值,未放置樣品時(shí)作為空白對(duì)照,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5次,樣品的不透明度用公式(1)計(jì)算:

式(1)

式中:A600為膜在波長(zhǎng)為600 nm處的OD值;d為膜厚度,mm。

1.2.6 水蒸氣透過(guò)性的測(cè)定 參照GB/T 037-1988《塑料薄膜和片材透水蒸氣性試驗(yàn)方法杯式法》[23],選擇厚度均勻的膜樣品,用石蠟密封于裝有無(wú)水氯化鈣的透濕杯口,并將透濕杯置于溫度為25 ℃、相對(duì)濕度為75%的干燥器(內(nèi)裝飽和氯化鈉溶液)中,每隔24 h稱(chēng)透濕杯的質(zhì)量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5次。計(jì)算公式見(jiàn)式(2)。

式(2)

式中:Δm為t時(shí)間內(nèi)的質(zhì)量增量,g;d為試樣厚度,m;A為試樣透水蒸氣的面積,m2;Δp為試樣兩側(cè)的水蒸氣壓差,Pa;t為質(zhì)量穩(wěn)定后的兩次間隔時(shí)間,s。

1.2.7 拉伸性能的測(cè)定 采用GB/T 1040.3-2006《塑料拉伸性能的測(cè)定》[24]方法,用微機(jī)控制電子萬(wàn)能拉力機(jī)測(cè)定膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率。將膜裁成150 mm×15 mm的矩形,測(cè)定前在25 ℃、相對(duì)濕度為50%條件下平衡2 d,用螺旋測(cè)微器測(cè)膜的中心及四角的厚度(取平均值),設(shè)定原始標(biāo)距為100 mm,拉伸速率為50 mm/min,記錄膜斷裂時(shí)的最大長(zhǎng)度與最大拉力。膜樣品測(cè)定重復(fù)5次。計(jì)算公式見(jiàn)式(3)和式(4):

式(3)

式(4)

式中:Fmax為膜樣品斷裂時(shí)的最大拉力,N;l為膜樣品寬度,mm;d為膜樣品厚度,mm;l1為膜樣品斷裂時(shí)的最大長(zhǎng)度,mm;l0為膜樣品的初始長(zhǎng)度,mm。

1.2.8 抑菌活性測(cè)定 參照陳桂蕓等[25]的方法,并稍做修改。以大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC 25922)為試驗(yàn)菌種,用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)活化,經(jīng)10倍稀釋法配制成菌落數(shù)為1×106CFU/mL的菌懸液。將50 ℃左右的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿,冷卻20 min到凝固,加入0.1 mL菌懸液,涂布均勻制成帶菌平板,將裁成直徑為0.6 cm的膜樣品貼于平板中央,倒置于培養(yǎng)箱中,在37 ℃下培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑(十字交叉法)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定5次,以殼聚糖膜為空白對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜分析

殼聚糖復(fù)合膜(AP/CH-film)紅外光譜見(jiàn)圖1,所有樣品的紅外光譜圖顯示相似的圖譜形狀,為殼聚糖膜的典型紅外光譜特征。單一殼聚糖膜(CH-film)在3240 cm-1具有強(qiáng)吸收,主要由是-NH和-OH的伸縮振動(dòng)引起;在2930 cm-1處是-CH2-基團(tuán)吸收峰,2880 cm-1吸收峰是-CH3的特征吸收;1630、1550及1340 cm-1為酰胺吸收峰,在1630 cm-1為C=O伸縮振動(dòng)峰(酰胺Ⅰ帶)、1550 cm-1為N-H伸彎曲振動(dòng)峰(酰胺Ⅱ帶)及1340 cm-1為C-N伸縮振動(dòng)產(chǎn)生(酰胺Ⅲ帶);1411 cm-1吸收峰與羧酸酯基團(tuán)有關(guān),而1020 cm-1的吸收峰是C-O-C鍵的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)形成,這些典型的殼聚糖膜紅外光譜特征與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[10,21,26],且在復(fù)合膜(AP/CH-film)光譜中均能被觀察到。添加藻藍(lán)蛋白復(fù)合膜光譜特征除在3240 cm-1的吸收峰向高波方向有輕微漂移外,其它位置的吸收峰強(qiáng)度與位置基本不變。復(fù)合膜具有相同的光譜特征和漂移情況可以推斷,盡管在成膜過(guò)程中藻藍(lán)蛋白與殼聚糖分沒(méi)有共價(jià)鍵和化學(xué)作用的變化發(fā)生,但能形成分子間氫鍵[27]。與單一殼聚糖膜相比,AP/CH-film復(fù)合膜沒(méi)有新峰出現(xiàn),表明AP與殼聚糖相容。

圖1 AP/CH-film的紅外光譜圖

2.2 微觀結(jié)構(gòu)掃描觀察

膜的形態(tài)在一定程度上決定了其理化性質(zhì),AP/CH-film電鏡掃描結(jié)果如圖2所示。在1000放大倍數(shù)下,單一殼聚糖膜表面有明顯紋理,AP/CH-film復(fù)合膜相對(duì)較為光滑平整,且這種表面形態(tài)隨藻藍(lán)蛋白比例的添加更為明顯。SEM分析表明,膜表面、斷面是均勻的,沒(méi)有裂紋以及氣孔,藻藍(lán)蛋白與殼聚糖膜復(fù)合具有很好的相容性。與陳桂蕓等制備的植物蛋白復(fù)合膜(玉米蛋白/殼聚糖)復(fù)合膜相比,AP/CH-film復(fù)合膜內(nèi)外部沒(méi)有明顯裂紋、氣孔[25];與Zhang等制備的菜籽蛋白-殼聚糖復(fù)合膜相比,AP/CH-film復(fù)合膜表面平整、無(wú)皺紋[28]。

圖2 AP/CH-film的掃描電鏡表面和截面圖

2.3 AP/CH-film的不透明度

不透明度是影響包裝膜材料總體外觀和消費(fèi)者接受性的重要指標(biāo)。AP/CH-film的不透明度結(jié)果見(jiàn)表1,復(fù)合膜的不透明度隨AP添加量的增加而顯著增大(P<0.05)。CH-film的不透明度為1.124 Abs600·mm-1,當(dāng)添加量為1.0%時(shí),AP/CH-film的不透明度為3.927 Abs600·mm-1,增加了2.4倍。由于AP是捕光色素蛋白,與殼聚糖分子復(fù)合時(shí),在一定程度上增加了復(fù)合膜對(duì)可見(jiàn)光的吸收,增大了不透明度。此外,藻藍(lán)蛋白分子與殼聚糖大分子能夠形成致密結(jié)構(gòu)(見(jiàn)SEM結(jié)果),影響到光線透射率,同時(shí)也會(huì)增大復(fù)合膜的不透明度。AP/CH-film復(fù)合膜這種降低光線的透射性,在一定程度上會(huì)影響到肉裝物的可視性,而對(duì)光敏食品具有一定阻光性。

表1 AP/CH-film的物理性質(zhì)及機(jī)械性能

2.4 AP/CH-film的水蒸氣透過(guò)性

包裝材料的良好阻隔性是保證產(chǎn)品質(zhì)量的主要性能之一,水蒸氣透過(guò)性決定水蒸氣在內(nèi)外部環(huán)境中相互滲透程度,影響著產(chǎn)品質(zhì)量。表1為AP/CH-film的水蒸氣透過(guò)系數(shù),當(dāng)AP添加量為0.75%,AP/CH-film的水蒸氣透過(guò)系數(shù)顯著降低(P<0.05),AP的添加在一定程度增強(qiáng)了復(fù)合膜的水蒸氣阻隔性能。復(fù)合膜水蒸氣透過(guò)系數(shù)與其自身結(jié)構(gòu)有關(guān)[29],AP的摻入可與殼聚糖膜分子形成更均一結(jié)構(gòu),改變了膜結(jié)構(gòu),降低水蒸氣分子在膜鏈中遷移率,在一定程度上阻礙了水蒸氣滲透性。

2.5 AP/CH-film的機(jī)械性能

膜的機(jī)械性能對(duì)于保證食品在運(yùn)輸與貯藏過(guò)程中的免受外力損傷等方面起著非常重要的作用[30]。如表1所示,復(fù)合膜AP/CH-film的抗拉強(qiáng)度隨著AP的添加量增加而顯著降低(P<0.05)。單一CH-film的抗拉強(qiáng)度為16.22 MPa,當(dāng)添加0.75%AP時(shí),AP/CH-film的抗拉強(qiáng)度顯著減小到13.73 MPa(P<0.05);AP/CH-film斷裂伸長(zhǎng)率隨AP含量增加而增大,1.0% AP/CH-film的斷裂伸長(zhǎng)率為79.73%。類(lèi)似研究報(bào)道,以明膠蛋白與殼聚糖制膜,在優(yōu)化配比6∶4條件下復(fù)合膜斷裂伸長(zhǎng)率可增加到30.46%[31];此外,陳桂蕓等[25]發(fā)現(xiàn)玉米醇蛋白復(fù)合膜在殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí),斷裂伸長(zhǎng)率可提高到6.67%。蛋白可增加殼聚糖復(fù)合膜的斷裂伸長(zhǎng)率,藻藍(lán)蛋白的這種增強(qiáng)作用尤其明顯。膜的機(jī)械性能主要與膜基質(zhì)中的聚合物主鏈之間分子內(nèi)和分子外相互作用的分布及密度有關(guān)[32]。藻藍(lán)蛋白為水溶性高分子化合物,當(dāng)與殼聚糖溶液混合成膜時(shí),AP與殼聚糖分子間形成的作用力,使殼聚糖膜分子結(jié)構(gòu)排布受到影響,改變了殼聚糖膜分子鏈的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),致使變形抗力減小,抗拉強(qiáng)度降低;藻藍(lán)蛋白分子與殼聚糖分子鏈能夠充分纏結(jié),交聯(lián)形成更均勻的結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)對(duì)膜機(jī)械性能有積極作用[25],能夠改善膜材料的柔韌性,提高復(fù)合膜的斷裂伸長(zhǎng)率。

2.6 AP/CH-film的抑菌性

圖3 AP/CH-film的抑菌活性

3 結(jié)論

相比殼聚糖膜,適當(dāng)添加藻藍(lán)蛋白使得AP/CH-film復(fù)合膜在阻光性、阻濕性、延展性、抑菌性方面有所增強(qiáng)。1.0% AP/CH-film表面更均一光滑,具有較高的不透明性，可有效阻隔光線引起內(nèi)裝物成分的改變,且較低的水蒸氣透過(guò)率可延長(zhǎng)內(nèi)裝物水分含量穩(wěn)定期;與復(fù)合其他蛋白物質(zhì)相比,復(fù)合藻藍(lán)蛋白可提高AP/CH-film的延展性,且具備較強(qiáng)的抗菌特性,這一特點(diǎn)在制備可纏繞食品保鮮包裝材料、藥物緩釋材料等方面具有很大潛力。鑒于本研究抑菌試驗(yàn)菌種只有細(xì)胞大腸桿菌,復(fù)合膜在其它致病菌抑菌性能有待于進(jìn)一步研究,且AP/CH-film復(fù)合膜抑菌機(jī)理及在食品保鮮中的應(yīng)用也需要深入研究。