粗壯脈紋孢菌高密度培養基的優化及補料策略

魏長浩,曹 余,鄒新華,范亞葦,李 靜,李紅艷,鄧澤元,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.播恩生物技術股份有限公司,江西贛州 341000)

粗壯脈紋孢菌(Neurosporacrassa)是本實驗團隊從江西本土發酵豆渣食品中分離篩選得到的一株具備較強的產酶能力和產類胡蘿卜素能力的優良真菌[1]。目前,粗壯脈紋孢菌已在多種農副產品的發酵利用中取得好結果。葉俊等[2]利用粗壯脈紋孢菌固態發酵豆渣發現,在發酵48 h后,豆渣中的粗纖維含量得到了有效的降低,并且粗蛋白、可溶性總糖等營養成分都有提高。任志青等[3]以豆粕為發酵底物,發現在發酵過程中纖維素得到了有效的降解,形成了糖類物質;并且植酸等抗營養因子的含量也都有顯著的下降。于新穎[4]利用它來發酵菜籽粕,在利用粗壯脈紋孢菌固態發酵菜籽粕時也得到了相似的結果,并得出結論,利用粗壯脈紋孢菌固態發酵菜籽粕可以很好地改善菜籽粕的營養水平,提高菜籽粕的利用價值。不僅如此,Zhou等[5]還通過研究發現粗壯脈紋孢菌發酵豆渣中提取的低聚糖具有出色的益生作用,說明經粗壯脈紋孢菌發酵后的豆渣很有可能是極具潛力的益生食品;李靜等[1]以及杜佳等[6]通過對發酵產類胡蘿卜素進行提取以及相關活性的測定,發現粗壯脈紋孢菌發酵后可以提取得到較高含量的類胡蘿卜素,并且具有較高的抗氧化活性。此外粗壯脈紋孢菌高產纖維素酶以及蛋白酶的特性也是值得關注的方面,也正是因為高活性的酶系,為粗壯脈紋孢菌更好地發酵農副產物奠定了良好的基礎[7-8]。

高密度培養(HCDC,high cell density culture)是一種提高菌體密度的發酵方式,它沒有確切的意義,本身只是一個相對的概念[9]。高密度培養與常規培養方式相比,最顯而易見的優勢就是可以收獲大量的菌體,大大提高生產效率和營養物質利用率、縮短生產周期、減少設備投資,從而降低成本、節約資源、減少污染,提高綜合生產效率[10]。而合適的培養基組成與培養方式是實現菌體高密度培養的重要因素。就培養基組成而言,在分批培養過程中,當培養體系中的營養成分(包括碳源、氮源和無機鹽等)的濃度超過某一臨界值時,微生物會為維持胞內環境而消耗部分能量,其結果會明顯抑制菌體生長,降低菌體得率[11]。因此為實現高密度培養,合適的培養基組成不可或缺。Wang等[12]通過優化鼠李糖桿菌最佳培養基組成,在最優條件下細胞密度提高到4.5×109CFU/mL,比乳酸細菌培養基(MRS培養基)高約9倍。就培養方式而言,補料分批培養是實現高密度培養的重要手段[13]。補料分批培養是通過補加新鮮培養液,為微生物提供充足的養分,從而使細胞達到較高密度的培養方式,相對于其他培養方式,補料分批培養可以削弱底物抑制,稀釋有毒代謝物,最終達到細胞高密度培養。Chen等[14]發現,通過補加含C、N、P和微量元素的補料培養基對紅曲霉進行分批補料培養,比常規分批培養菌體量提高四倍。Ji等[15]也發現,利用分批補料培養高山被孢霉能顯著縮短培養周期并提高代謝產物量。

在國內外已報道的研究中,粗壯脈紋孢菌所表現出的改善農副產品營養價值的作用十分可觀,但在以往的固態培養方式中粗壯脈紋孢菌的菌體產量十分有限,限制了其在大批量工業生產中應用,因此研究粗壯脈紋孢菌的高密度培養技術具有極大的應用價值。本研究從優化粗壯脈紋孢菌培養基組成入手,對高密度培養基的碳源、氮源、無機鹽的組成與含量進行了優化,然后對比了補料時間、補料次數和補料碳氮比對粗壯脈紋孢菌生物量的影響,選擇一種能夠積累較高菌體生物量的補料培養策略。旨在實現粗壯脈紋孢菌菌體的高密度培養,為工業生產中的制種提供參考,為粗壯脈紋孢菌這一優良菌種工業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗壯脈紋孢菌(NeurosporacrassaCGMCC NO.3088) 由本實驗團隊篩選分離并保存;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、玉米漿(發酵型)、酵母粉(生化試劑) 上海索萊寶生物科技有限公司;蛋白胨(生化試劑) 上海盛思生化科技有限公司;所有鹽類試劑均為國產分析純。

HPX-160BSH恒溫恒濕箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;DGG-9140A型電熱鼓風干燥器 上海精宏實驗設備有限公司;FA1104型電子天平 上海精天電子儀器廠;HD-650桌上型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;BSD-YF2200智能精密搖床 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;ELX800全自動酶標儀 美國BioTek公司;PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 菌種活化:將甘油保藏的菌種接入沙氏液體培養基中,于30 ℃、140 r/min下搖瓶培養72 h,連續活化3次。

種子液的制備:將菌種接種至馬鈴薯瓊脂糖培養基試管斜面上,于30 ℃、濕度70%、光照條件下培養96 h,在無菌操作臺內用接種環刮取孢子并與水混合,混合液過濾除去菌絲后加水稀釋成1×106個/mL孢子懸液。

發酵培養:配制液體發酵培養基[14](葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、磷酸二氫鉀4 g/L,七水合硫酸鎂0.5 g/L,七水合硫酸鋅0.01 g/L,氯化鉀0.5 g/L,硫酸錳0.03 g/L),按80 mL的裝液量分裝于250 mL錐形瓶中,滅菌后接種4 mL 1×106個/mL孢子懸液。置于30 ℃、140 r/min的恒溫搖床中培養96 h。

1.2.2 菌密度測定及菌體生物量的測定 采用血球計數板法進行計數,計算種子液中的菌體密度。

菌體生物量的測定參照Chen等[14]及劉靖[16]的方法,將發酵液過濾,并用大量蒸餾水洗滌殘留物,獲得殘留菌體,于80 ℃下烘干至恒重得到菌絲體干重(DW,dry weight)。

式中:DW表示菌絲體干重,g;V表示培養基的體積,mL。

1.2.3 生長曲線的繪制 在基礎培養基及培養條件的情況下對粗壯脈紋孢菌進行液態搖瓶培養,從0 h開始至120 h結束,每間隔6 h 取樣測定菌體生物量并繪制生長曲線。

1.2.4 發酵培養基的優化

1.2.4.1 不同碳源對粗壯脈紋孢菌高密度培養的影響 在保證氮源和無機鹽種類及所有營養物質濃度不變的情況下,使用乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉作為不同的碳源替換發酵培養基中的碳源,在基礎培養條件下培養96 h,并對發酵液進行生物量的測定、比較分析,確定最佳碳源。

1.2.4.2 不同氮源種類對粗壯脈紋孢菌高密度培養的影響 在最佳碳源條件下,保證無機鹽種類及所有營養物質濃度不變,使用硫酸銨、蛋白胨、酵母粉、玉米漿、硝酸鈉作為不同的氮源替換發酵培養基中的氮源,在基礎培養條件下培養96 h,并對發酵液進行生物量的測定、比較分析,確定最佳氮源。

1.2.4.3 不同蔗糖含量對粗壯脈紋孢菌高密度培養的影響 在最佳碳源和最佳氮源條件下,保證無機鹽種類、氮源濃度及無機鹽濃度不變,使用10、20、40、60、80、100 g/L作為不同蔗糖濃度替換發酵培養基中的葡萄糖含量并保持其余營養物質濃度不變,在基礎培養條件下培養96 h,對發酵液進行生物量的測定、比較分析,確定最佳蔗糖含量。

1.2.4.4 不同蛋白胨的含量對粗壯脈紋孢菌高密度培養的影響 在最佳碳源、最佳氮源以及最佳碳源濃度的條件下,保證無機鹽種類及濃度不變,使用10、20、30、40、50、60 g/L作為不同蛋白胨濃度替換發酵培養基中的蛋白胨含量,在基礎培養條件下培養96 h,并對發酵液進行生物量的測定、比較分析,確定最佳蛋白胨的含量。

1.2.4.5 不同無機鹽含量對粗壯脈紋孢菌高密度培養的影響 在最佳碳氮源以及最佳碳氮源濃度條件下,除考察因素外其余無機鹽種類及濃度不變,以KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、KCl、MnSO4·H2O為考察因素分別設定濃度梯度KH2PO4(1、3、5、7、9、11 g/L)、MgSO4·7H2O(0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L)、ZnSO4·7H2O(0、0.01、0.06、0.11、0.16、0.21、0.26 g/L)、KCl(0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L)、MnSO4·H2O(0、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 g/L),考察不同無機鹽及其濃度對菌體生物量的影響。

1.2.5 響應面法優化發酵培養基 利用Box-Benhnken(BB)實驗方法[17],選擇碳源含量、氮源含量、磷酸鹽含量以及硫酸鋅含量為關鍵因素,采用4因素3水平進行響應面分析,應用 Design-Expert 11軟件設計并分析實驗結果(每組實驗重復三次),得到最適合粗壯脈紋孢菌生長的培養基配方。

1.2.6 粗壯脈紋孢菌高密度培養補料策略的確定

1.2.6.1 補料時間的確定 通過粗壯脈紋孢菌搖瓶分批發酵動力學曲線確定補料時間。以最適培養基對粗壯脈紋孢菌進行培養,從0 h開始至120 h結束,每間隔12 h 取樣測定菌體生物量及殘糖含量,并繪制動力學曲線。

1.2.6.2 補糖濃度的確定 選取40、80、120、160、200、400 g/L的蔗糖溶液作為不同糖濃度的補料液,在補料時間24～96 h內,每隔12 h向揺瓶中補加10 mL不同糖濃度的補料液,培養至108 h,對發酵液進行生物量的測定,并設置對照組,觀察不同補糖濃度對粗壯脈紋孢菌生長的影響,確定最佳補糖濃度。

1.2.6.3 補料次數的確定 選取補料1次(24 h補料一次)、補料3次(每隔36 h補料一次)、補料4次(每隔24 h補料一次)、補料7次(每隔12 h補料一次)作為不同補料次數,在補料時間24～96 h內,每次向揺瓶中補加200 g/L的蔗糖溶液10 mL,培養至108 h,對發酵液進行生物量的測定,并設置對照組,觀察不同補料次數對粗壯脈紋孢菌生長的影響,確定最佳補料次數。

1.2.6.4 補料碳氮比的確定 在補料液中保持碳源濃度不變,選取1∶0、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1作為不同補料碳氮源濃度比,分別在培養24、60、96 h時向揺瓶中補加10 mL不同碳氮濃度比的補料液,培養至108 h,對發酵液進行生物量的測定,并設置對照組,觀察不同補料碳氮濃度比對粗壯脈紋孢菌生長的影響,確定最佳補料碳氮濃度比。

1.2.7 糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法測定發酵液中糖的含量[18]。取1 mL樣液加入1 mL 6%的苯酚及5 mL的濃硫酸,搖勻,靜置反應20 min后于490 nm測定其吸光值。使用不同濃度的葡萄糖溶液繪制標準曲線,蒸餾水為空白對照,對發酵液樣品中糖含量進行定量。

葡萄糖標準曲線:y=5.6743x+0.086(R2=0.9968)

1.3 數據處理

使用Design Expert 11進行響應曲面設計和分析,用Origin 2017軟件制圖并對菌體生長曲線進行Logistics方程擬合以及生長速率的計算,用SPSS 19軟件進行顯著性分析(P<0.05),結果以(平均值±標準差)表示。

2 結果與分析

2.1 菌絲體生長曲線

粗壯脈紋孢菌的生長曲線見圖1。圖1表明粗壯脈紋孢菌的生長規律符合微生物生長一般規律。從 0～6 h,菌體濃度上升緩慢,菌體處于遲緩期,從第6 h開始,菌體生物量迅速上升,從 0.125 g/L驟增至96 h的6.088 g/L,該時間段包括了菌種的對數生長期,菌體細胞高速生長繁殖;從96 h 開始,菌體生長趨于平穩,至120 h實驗結束,該階段菌種處于穩定期,即新繁殖的菌體與衰亡的菌體數相等,或正生長與負生長相等的動態平衡中。造成該現象的原因是由于培養基中營養物質的消耗,毒性代謝產物積聚,pH下降,使菌體的繁殖速度漸趨減慢[19]。因此確定菌體生長時間為0～96 h。

圖1 粗壯脈紋孢菌培養生長曲線

2.2 發酵培養基成分的優化

2.2.1 碳源的選擇 由圖2可知,不同種類的碳源對粗壯脈紋孢菌生物量的影響差異明顯,其中利用蔗糖作為碳源能獲得最大的生物量7.238 g/L,而淀粉、麥芽糖和葡萄糖的生物量分別只有6.256、5.963、5.088 g/L,均低于蔗糖的生物量。當使用乳糖作為碳源時,菌體生物量為最低值1.219 g/L,說明乳糖最不適合作為粗壯脈紋孢菌生長的碳源。綜上所述,選擇蔗糖作為培養基碳源進行下一步優化。

圖2 不同碳源對粗壯脈紋孢菌生物量的影響

2.2.2 氮源的選擇 由圖3可知,蛋白胨相對于其他四種氮源來說,能收獲最大的菌體量7.450 g/L,其次是酵母粉6.944 g/L和玉米漿5.150 g/L,因此選擇蛋白胨作為培養基氮源進行下一步優化。從圖中還可以看出,以有機氮源的玉米漿、酵母粉以及蛋白胨為培養基唯一氮源時,所獲得的菌體量要遠大于無機氮源硫酸銨和硝酸鈉作為培養基氮源。魏培蓮等[20]在進行發酵紅曲霉培養基優化過程中也發現相對于無機氮源硝酸銨,蛋白胨、酵母粉和牛肉膏等有機氮源作為唯一氮源時能得到更大的生物量。結果表明,粗壯脈紋孢菌在有機氮源作為唯一氮源的情況下能獲得更好的生長。

圖3 不同氮源對粗壯脈紋孢菌生物量的影響

2.2.3 碳源、氮源、無機鹽添加水平的選擇

2.2.3.1 蔗糖添加量的選擇 從圖4中可以看出,隨著蔗糖添加量的提升,菌體生物量呈現一個先增后減的趨勢,在蔗糖濃度為40 g/L時,菌體生物量達到最高8.856 g/L。說明過低的蔗糖含量可能導致營養物質不足,菌體的生長受到限制,反之過高的糖含量其本身就會直接限制菌體的生長[11]。因此蔗糖添加量選擇40 g/L時用來發酵培養效果最佳。

圖4 不同蔗糖濃度對生物量的影響

2.2.3.2 蛋白胨添加量的選擇 從圖5中可以看出,隨著蛋白胨添加量的增加,生物量呈現與不同蔗糖濃度生物量相近的變化趨勢,當蛋白胨添加量選擇40 g/L時，可以獲得最大的生物量10.506 g/L,用來發酵培養效果最佳。

圖5 不同蛋白胨濃度對生物量的影響

2.2.3.3 無機鹽添加量選擇 由圖6(a)和圖6(c)可知,五種無機鹽中,磷酸二氫鉀和硫酸鋅隨著濃度變化對生物量有著明顯的影響,磷酸二氫鉀濃度為3 g/L時生物量達到最大,硫酸鋅為0.01 g/L時生物量達到最大。硫酸錳和氯化鉀在一定的濃度內,對生物量的影響基本保持一個范圍內波動。硫酸鎂則隨著濃度的增加,生物量呈現先增加后平穩的趨勢,無法確定峰值,說明適量就可。因此確定硫酸鎂、硫酸錳、氯化鉀的添加量分別為0.1、0.03、0.1 g/L,并選擇磷酸二氫鉀和硫酸鋅兩種無機鹽進行下一步的優化。

圖6 不同種類無機鹽及濃度對粗壯脈紋胞菌生物量的影響

2.2.4 響應面優化試驗 通過上述單因素實驗,確定了蔗糖添加量、蛋白胨添加量、磷酸二氫鉀添加量以及硫酸鋅添加量作為實驗因素,其他培養基成分按硫酸鎂0.1 g/L、硫酸錳0.03 g/L、氯化鉀0.1 g/L添加。利用Design Expert 11軟件進行響應曲面實驗設計,詳見表1。

表1 響應面試驗因素和水平表

表2 響應面試驗設計方案及結果

表3 響應面二次方模型方差分析

由表3可知,該實驗所構建的模型P<0.0001,極為顯著;且擬合模型的失擬項P值為0.0698>0.05,不顯著;結果表明模型在整個回歸區域內的擬合度高,與實際情況相似。同時對實驗結果進行方差分析,得到模型擬合方程為:生物量(g/L)=11.3425+0.178125A+0.0427083B-0.071875C+0.669792D-1.08125AB+0.24375AC+0.803125AD+0.346875BC-0.75625BD+0.08125CD-0.998854A2-0.458229B2-0.448854C2-1.55198D2。模型的確定系數R2=0.9516,校正后的系數R2=0.9033,也說明模型擬合程度良好。而且從各項的方差分析中可以看出,各因素對生物量的影響從大到小排序為:D>A>C>B,表中D,AB,AD,BD,A2,D2,B2,C2對響應值影響極顯著(P<0.01)。

表4 不同補糖濃度對粗壯脈紋孢菌生物量的影響

表5 不同補料次數對粗壯脈紋孢菌生物量的影響

由圖7可知，AB、AD、BD交互作用的等高線呈橢圓形，說明其對響應值影響顯著，與方差分析結果一致。根據響應曲面模型計算,當蔗糖濃度為42.356 g/L、蛋白胨濃度為35.938 g/L、磷酸二氫鉀濃度為2.614 g/L、硫酸鋅濃度為0.038 g/L時,可以得到最大的菌體生物量11.483 g/L。使用響應曲面模型得到的最佳培養基進行驗證實驗,實際條件為：蔗糖42 g/L，蛋白胨36 g/L，磷酸二氫鉀2.6 g/L,硫酸鋅0.038 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，硫酸錳0.03 g/L，氯化鉀0.1 g/L,得到的菌體生物量為11.295 g/L,與模型預測值接近,由此可知,基于響應曲面法優化得到的粗壯脈紋孢菌最佳培養基組成數據可靠,具有實際利用價值。

圖7 各因素交互作用響應曲面及等高線圖

2.2.5 粗壯脈紋孢菌分批補料策略的確定

2.2.5.1 粗壯脈紋孢菌補料時間的確定 由圖8、圖9可以看出,菌體生長在12 h之前都處于一個十分緩慢的階段,培養基的糖含量并沒有大幅度的下降;12 h以后,菌體生長速度加快,糖消耗量也逐漸增多,表明菌體生長進入了指數期;培養至96 h時菌體生物量達到了最大值11.295 g/L,之后菌體生長進入穩定期,同時作為碳源的糖類物質含量下降到極少。結合糖消耗曲線以及菌體生長速率曲線來看,12～36 h的糖消耗速率極快,生長速率也極快的增加,說明這一段時間菌體在高速生長。36 h后生長速率開始下降,說明糖含量的降低已經對菌體的生長造成了影響[21]。因此,綜合考慮確定補料的時間為24～96 h,每12 h進行一次補料,培養至108 h停止。

2.2.5.2 粗壯脈紋孢菌分批補料碳源濃度的確定 由表4可知,通過搖瓶分批補料的方式確定最適補糖濃度為200 g/L,培養108 h后可收獲8.351±0.228 g/L菌絲體,且發現過高和過低的補糖濃度均會限制粗壯脈紋孢菌的生長。與不添加補料培養基的對照組比較生物量明顯降低,原因是補加的培養基會稀釋原培養基中的菌體密度并且導致培養基中各類營養成分發生變化。王有旭[22]在黑曲霉的補料分批培養產檸檬酸的研究中發現,隨著補料次數的增加導致補料量過大,發酵指數和轉化率都呈現逐漸降低趨勢,殘糖含量也會隨之上升。因此考慮通過改變補料次數,來減弱補料這一方式對菌體帶來的不利影響,從而獲得更多的生物量以達到高密度培養的目的。

表6 不同補料碳氮比對粗壯脈紋孢菌生物量的影響

圖8 最適培養基下的粗壯脈紋孢菌生長曲線及不同發酵時間的殘糖含量

圖9 粗壯脈紋孢菌生長速率曲線

2.2.5.3 粗壯脈紋孢菌分批補料次數的確定 由表 5 可知,在0～108 h的補料培養時間內,當補料次數為3次時,可獲得最大生物量15.092±0.283 g/L。過少補料次數的實驗組雖然與未進行補料的對照組相比生物量有所增加,但生物量還是低于補料三次的實驗組,原因可能是菌體生長過程中因為補料過少營養物質供給不足從而影響菌體的生長,反之過多的補料次數的實驗組則會因為加入了過多的培養基,從而改變菌體密度,降低溶氧量,導致菌體生物量降低。因此,選擇補料3次為最佳補料次數。

2.2.5.4 粗壯脈紋孢菌分批補料碳氮比的確定 碳氮比是補料培養基中不可忽視的一項重要因素,碳氮比過高和過低都不利于細胞生長和外源蛋白表達和積累,過低導致菌體提早自溶;過高導致細菌代謝不平衡,最終不利于產物的積累,嚴重影響菌體的生長和代謝[16,23]。在搖瓶培養中,以蔗糖作為微生物培養基碳源,蛋白胨作為氮源,保證碳源濃度和補料添加量不變的情況下對粗壯脈紋孢菌進行分批補料培養。由表6可知,相對于不添加任何物質的對照組相比,只添加碳源能得到最大的菌體生物量,并且隨著氮源添加量的下降,菌體反而呈現一個生長更加旺盛的趨勢。說明在粗壯脈紋孢菌的初始培養基中氮源充足且不會成為菌體生長的限制性因素,因此不需要補加氮源。

3 結論

本研究以粗壯脈紋孢菌作為研究菌種,對其高密度培養的培養基組成以及分批補料培養方法進行了探索。實驗結果表明,合適的粗壯脈紋孢菌培養基組成以及間歇補料方式能有效地促進粗壯脈紋孢菌的生長。在最佳培養基組成:蔗糖42 g/L、蛋白胨36 g/L、磷酸二氫鉀2.6 g/L、硫酸鋅0.038 g/L、硫酸鎂0.1 g/L、硫酸錳0.03 g/L、氯化鉀0.1 g/L的基礎上分別于培養24、60、96 h進行補料,共補料3次,每次補加200 g/L的蔗糖溶液10 mL,可獲得粗壯脈紋孢菌的最大生物量14.732 g/L,是未優化之前粗壯脈紋孢菌生物量的2.42倍。結果表明通過發酵技術實現粗壯脈紋孢菌的高密度培養是切實可行的,也為之后大批量工業化制種提供了一定的理論支持。對于其他補料方式,如恒pH補料以及葡萄糖反饋補料等對菌體生長的影響以及發酵罐放大實驗還有待進一步的探索和優化。