產GABA乳酸菌的篩選鑒定及其發酵條件研究

李 歡,潘道東,2,*,吳 振,曾小群,吳愛娟

(1.寧波大學浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室,浙江寧波 315800;2.南京師范大學食品科學與營養系,江蘇南京 210097)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)又名氨絡酸,是由谷氨酸經谷氨酸脫羧酶(Glutamic acid decarboxylase,GAD)催化轉化而來[1]的一種廣泛存在于動物[2-3]、植物[4]和微生物[5]中的非蛋白組成的天然氨基酸,是哺乳動物中樞神經系統中很重要的抑制性神經遞質[6]。它能改善大腦細胞代謝,增強免疫力[7],減少焦慮[8],改善睡眠[9],治療癲癇[10],改善肝腎功能,降血壓[4]和預防糖尿病[11]。目前絕大部分治療大腦疾病的中西醫配方中均含有GABA,其副作用小且安全有效。GABA已成為現代社會新型功能性因子,正逐步被廣泛用于醫藥[10-12]、食品[13-14]、保健、化工及農業等行業。

目前,GABA的制備主要有化學法、植物富集法和微生物發酵法3種途徑[15-16],其中,化學法原料價格高,分離效果差,涉及有機溶劑等不安全,使用范圍存在較大的局限性,不能用于食品、藥品等方面;植物富集法簡單易操作,相對安全,但在實際的工業化生產中,植物富集法仍然存在主要限制,例如低產率,難以分離和提取等;微生物發酵法生產GABA 是一種更安全且最常用的方法[17]。微生物發酵法是以谷氨酸或其鈉鹽、富含谷氨酸的物質等為原料,利用酵母菌、乳酸菌和曲霉菌等具有GAD活性的微生物發酵制得,其產品成本低、有效成分含量高[18-19]。乳酸菌是一種常見益生菌,近年來,國內外均有報道乳酸菌具有合成GABA的能力[20-22],其中包括短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)[23]、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)[24]、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)[25]、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)[26]、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)[27]、布氏乳桿菌[28]等。另外乳酸菌的食用安全性已得到充分證實和認可,利用乳酸菌發酵法制備GABA是目前的研究趨勢。

因此本文從傳統發酵食品中篩選得到高產GABA的乳酸菌菌株,并對其發酵過程中的影響因素進行研究,以提高其產量,為今后乳酸菌發酵法生產GABA的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

γ-氨基丁酸 ≥99%,色譜純,Sigma公司;L-谷氨酸鈉(L-Glu,BR) ≥98.5%,國藥集團化學試劑有限公司;其它試劑 均為國產分析純試劑;實驗菌株來源:傳統發酵酸奶、傳統自制泡菜 農家市售購買;MRS 培養基 用于乳酸菌的培養,青島高科園海博生物技術有限公司;GABA發酵培養基 向MRS基礎培養基中添加1%(w/v)L-谷氨酸鈉。

HD2025W磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司;YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;HZ-2210K-2恒溫培養箱 太倉市華利達實驗設備有限公司;Centrifuge 5804 R冷凍離心機 艾本德中國有限公司;FE20 pH計 梅特勒-托利多(儀器)上海有限公司;DG5031酶聯免疫檢測儀 上海繼錦化學科技有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司;ABI 2720 PCR儀 ABI公司;JY04S-3C凝膠成像系統 上海復日科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產GABA乳酸菌的篩選鑒定

1.2.1.1 菌株的分離純化 取1 mL樣品液加至9 mL無菌生理鹽水中,混合均勻,得到濃度梯度為10-1。依此類推,配制濃度梯度分別為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。分別取濃度梯度為10-4、10-5、10-6的菌液100 μL涂布于分離培養基中,于37 ℃恒溫箱中培養48 h。挑取帶有溶鈣圈,菌落形態為圓形、表面光滑、邊緣整齊、扁平隆起、乳白色的單個菌落采用三區劃線法反復純化,直至菌落形態一致。

1.2.1.2 發酵液產γ-氨基丁酸含量測定 挑取純化后革蘭氏染色呈陽性的菌株接種到MRS液體培養基中37 ℃培養24 h,再以3%的接種量接種于谷氨酸鈉發酵培養基中37 ℃培養24 h。發酵液12000 r/min(4 ℃,10 min)離心后取上清液進行γ-氨基丁酸含量測定。

薄層層析法定性測定:展層劑為正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶3 (v/v/v),其中加入0.4%茚三酮。以1 g/L谷氨酸鈉和1 g/L GABA標準品作參比,待測樣品取2 μL上清液點樣,展開后置于90 ℃顯色10 min。觀察斑點,層析圖譜中與GABA標準品Rf值相同的即為產γ-氨基丁酸菌株,顯色顏色越深含量越高。選取其中高產的菌株進行下一步GABA定量測定。

高效液相色譜法定量測定:色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18,流動相A為20 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH7.3):醋酸鈉2.72 g,三乙胺200 μL,加超純水至1 L,調節pH為7.3,流動相B為乙腈,其比例為4∶1。衍生試劑為OPA 20 mg,加β-巰基乙醇20 μL,乙腈5 mL,混合均勻。硼酸緩沖液:硼酸24.7 g,加超純水1 L,調pH為10.4。取上清液100 μL加入20 μL衍生試劑、100 μL硼酸緩沖液混合均勻后室溫反應5 min,0.22 μm濾膜過濾后上樣,進樣量為20 μL,流速為0.8 mL/min,在波長334 nm處分別對GABA標品和待測樣品進行紫外檢測。以GABA濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線,根據樣品峰面積測定發酵液中GABA的含量。

1.2.1.3 革蘭氏染色 將純化的有1.2.1.1所述菌落形態的產GABA菌株按革蘭氏染色試劑盒說明書進行操作,用顯微鏡觀察并記錄菌株形態,選取革蘭氏染色呈陽性的菌株進行下一步的發酵實驗。

1.2.1.4 生理生化鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》[29]和第八版《伯杰氏細菌鑒定手冊》[30]中的乳酸菌的生理生化鑒定試驗要求對高產GABA菌株進行鑒定,主要有觸酶試驗、糖發酵實驗(包括葡萄糖、乳糖、半乳糖、棉子糖、麥芽糖等)、吲哚試驗、H2S實驗、甲基紅實驗、硝酸鹽還原實驗等。

1.2.1.5 16S rDNA分子生物學鑒定 將上述篩選的高產乳酸菌株活化后使用細菌試劑盒進行DNA提取,以通用引物F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′),R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR反應體系為:10 μmol/L上下游引物各2 μL;1 μL DNA模板;25 μL Taq酶;加ddH2O補足至50 μL。反應條件:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,72 ℃延伸10 min,共30個循環。通過瓊脂糖核酸電泳對PCR產物進行驗證后將PCR產物送至生工工程生物(上海)股份有限公司測序,測序結果與NCBI中Gene Bank數據庫進行BLAST比對,用基因分析軟件MEGA 7.0構建系統發育樹,以鑒定菌種。

1.2.2 菌株生長曲線及pH變化曲線測定 取活化后的種子液,以3%的接種量接種于發酵培養基中,37 ℃靜置培養24 h。每隔2 h取培養液,以空白培養基作對照,于600 nm波長下測定其吸光值及pH,并以時間(h)為橫坐標,以OD600值和pH為縱坐標繪制菌株生長曲線及pH變化曲線。

1.2.3 菌株發酵產GABA的影響因素研究

1.2.3.1 菌株發酵條件影響因素研究 將菌株活化后,以GABA發酵培養基(葡萄糖20 g/L、酵母粉5 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO40.25 g/L、K2HPO42.0 g/L、吐溫-80 1.0 mL)作為基礎培養基,接種量3%、初始pH6.0、發酵溫度37 ℃、發酵時間24 h作為初始發酵條件,探究發酵條件接種量、初始pH、發酵溫度、發酵時間對菌株GABA含量的影響。其中設定接種量分別為2%、3%、4%、5%、6%,初始 pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,發酵溫度分別為31、33、35、37、39、41 ℃,發酵時間分別為12、24、36、48、60、72 h,每次單因素優化后取最優條件進行下一步實驗。

1.2.3.2 菌株發酵培養基成分影響因素研究 將菌株活化后,以GABA發酵培養基(葡萄糖20 g/L、酵母粉5 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO40.25 g/L、K2HPO42.0 g/L、吐溫-80 1.0 mL)作為基礎培養基,以最優發酵條件進行培養基優化試驗。試驗分別以2%的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖作為唯一碳源；以牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨作為單一氮源或復合氮源(1∶1),牛肉膏+蛋白胨、酵母粉+牛肉膏、蛋白胨+酵母粉，其中總氮比為2.5%,酵母粉∶牛肉膏∶蛋白胨為1∶1∶2,分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的L-谷氨酸鈉,進行單因素實驗,探究發酵培養基成分對菌株GABA含量和OD600的影響,其中,每次單因素優化后取最優條件進行下一步實驗。

以葡萄糖作為碳源,酵母粉和牛肉膏作為復合氮源,添加L-谷氨酸鈉,采用L9(34)四因素三水平設計正交試驗,如表1所示。在正交試驗條件下測定各組的GABA含量并分析計算,得出培養基成分最佳的搭配條件。

表1 L9(34)正交試驗設計表

1.3 數據處理

采用Origin 8.6軟件和IBM SPSS Statistics 21進行統計分析,每次試驗重復三次,采用Mean±SE表示。

2 結果與分析

2.1 平板菌落形態

試驗從傳統發酵食品中共篩選得到20株疑似乳酸菌菌株,該菌株在MRS固體培養基中生長的菌落形態為圓形、表面光滑、邊緣整齊、扁平隆起、乳白色的單個菌落。

2.2 發酵液中γ-氨基丁酸含量測定分析

2.2.1 薄層層析法定性測定分析 從實驗結果圖1中可以看出菌株6#、8#、10#、13#、14#有和GABA標準品相同的Rf值,其中菌株14#顯色顏色最深,說明其產GABA含量最高,因此可以判定,14#菌株具有發酵L-谷氨酸鈉高產γ-氨基丁酸的能力,為試驗篩選的目標菌株。

圖1 菌株發酵上清液薄層層析圖

2.2.2 高效液相色譜法定量測定分析 通過測定不同濃度時GABA標準樣品的峰面積得到標準曲線,當GABA質量濃度在0～1.0 g/L范圍時,峰面積與GABA濃度間的線性關系良好y=20660x+119.49(R2=0.9987)。試驗菌株測定結果如圖2所示,可以看出菌株14#發酵液中GABA含量最高,其產量為2.30 g/L。

圖2 菌株發酵液中GABA含量測定

2.3 乳酸菌株14#菌種鑒定分析

2.3.1 菌株革蘭氏染色及生理生化鑒定分析 對分離的目標菌株14#進行革蘭氏染色及生理生化指標鑒定,測定結果為:菌株革蘭氏染色為陽性,能厭氧生長,接觸酶實驗為陰性,能發酵葡萄糖、蔗糖、乳糖等,在10 ℃環境下生長,H2S實驗為陰性,吲哚實驗為陰性,具體生理生化鑒定結果見表2。

圖4 基于菌株14#構建的系統發育樹

表2 菌株生理生化鑒定結果表

2.3.2 16S rDNA序列分析 根據瓊脂糖核酸電泳圖3，確定菌株14#的DNA序列長度為1500 bp左右,將測序結果與NCBI中Gene Bank數據庫進行BLAST比對,并采用基因分析軟件MEGA 7.0構建系統發育樹,菌種同源性分析結果如圖4所示,菌株14#與數據庫中Lactobacillusplantarumstrain NBRC 15891(登陸號NR112690.1)屬于同一分支,同源性為99%,因此可以鑒定目標菌株14#為植物乳桿菌。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 菌株生長特性分析

由圖5可知,在接種4 h內,菌株OD600值變化均較小,生長處于延遲期,培養4 h后,OD600值幾乎呈指數增長趨勢上升,生長進入對數期,培養12 h后生長開始變緩,培養16 h后生長達到高峰,之后處于平衡狀態,生長進入穩定期。這與圖中菌株pH的變化趨勢相符,其pH下降快慢與菌株生長快慢呈現了一定的相關關系,這也說明了在發酵培養過程中乳酸菌能利用培養基中的碳源進行產酸反應,使培養基發酵液pH不斷降低。

圖5 植物乳桿菌14#生長曲線及pH變化曲線

2.5 菌株發酵產GABA的影響因素分析

2.5.1 發酵條件對GABA含量的影響 接種量、初始pH、溫度和發酵時間對GABA含量的影響測定結果如圖6所示。

圖6 發酵條件對GABA含量的影響

由圖6可知,接種量在2%～4%之間時,菌株濃度和GABA含量均呈現上升趨勢,在接種量為4%時達到最大,隨著接種量的繼續增大,GABA含量開始不斷降低。說明適宜的菌液濃度更有利于GABA含量的積累,因此可選擇4%作為菌株的適宜接種量;發酵培養基的初始pH在4.0～6.0范圍內時,菌株代謝產生的GABA含量不斷增加,其菌密度也在不斷增大,當pH為6.0時均達到了最大值,而后隨著初始pH的增大GABA產量隨之降低,而發酵終點的菌液濃度變化不大,說明在GABA合成過程中受pH的影響更大,可能是因為發酵液的pH較低,降低了谷氨酸脫羧酶的活性,限制了GABA的合成;當溫度在31～37 ℃時更利于GABA的產生及菌株的生長,呈現緩慢增長的趨勢,在37 ℃時GABA產量最高。當溫度大于37 ℃時,菌密度和GABA含量均大幅度下降,說明高溫不利于菌株中GABA的合成,溫度過高不僅限制了菌株的生長,還會影響酶的活性,使GABA合成變慢;當發酵時間在48 h內時,GABA的產量隨著時間的延長在不斷增大,在48 h時GABA含量達到最大,結合菌株生長特性說明菌株在生長穩定期及衰亡期仍可進行GABA的合成。而當發酵時間繼續增加時,GABA的含量幾乎趨于穩定,因此,綜合考慮原料的利用率及避免資源的浪費,可選擇48 h作為此菌株發酵合成GABA的最佳發酵時間。

2.5.2 發酵培養基成分對GABA含量的影響

2.5.2.1 碳源、氮源及L-谷氨酸鈉對GABA含量的影響 碳源、氮源及L-谷氨酸鈉對GABA含量的影響如圖7所示。

圖7 碳源、氮源及L-谷氨酸鈉對GABA含量的影響

由圖7可知,當分別選擇葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉及乳糖作為菌株發酵的唯一碳源時,菌株對碳源的利用程度存在一定的差異。其中,葡萄糖更有利于菌株的生長及GABA的合成。故可選擇葡萄糖作為發酵培養基碳源。對于單一氮源,牛肉膏更有利于GABA的合成,其次是酵母粉。在復合氮源中,當復合氮源為酵母粉和牛肉膏時,GABA的產量最大,而菌株生長差異不大,因此可以選擇酵母粉和牛肉膏作為復合氮源。另外,當發酵培養基中添加的L-谷氨酸鈉濃度為0.5%～1.5%時,GABA的產量增長較快,在L-谷氨酸鈉濃度為1.5%時達到最大值,當L-谷氨酸鈉濃度繼續增加時,GABA的含量變化較小,沒有出現明顯的變化趨勢。而對于菌株生長,該范圍內L-谷氨酸鈉的濃度對其菌密度影響不大,分析其原因可能是因為此時的菌體已達到最大GABA轉化率,且L-谷氨酸鈉是合成GABA的重要底物,對GABA的影響更大。因此選擇1.5%的L-谷氨酸鈉作為發酵培養基底物添加量。

2.5.2.2 發酵培養基成分正交優化分析 以葡萄糖作為碳源,以酵母粉和牛肉膏作為復合氮源,以L-谷氨酸鈉作為發酵底物,進行L9(34)正交試驗設計及結果分析如下:

由表3可知,各成分對GABA含量的影響順序為葡萄糖>L-谷氨酸鈉>酵母粉>牛肉膏,各試驗組中最優組合為A1B2C2D2,GABA含量為8.96 g/L,而極差分析的最優組合為A1B2C3D2,由于最優組合沒有在試驗中出現,因此需要進一步驗證。

表3 正交試驗結果表

2.5.2.3 正交優化驗證試驗分析 根據優化結果,將菌株活化后以4%的接種量接種于上述優化的發酵培養基中,37 ℃恒溫培養48 h。取發酵后菌液測定其γ-氨基丁酸含量及菌密度大小,結果如表4。優化后GABA含量(9.12 g/L)較優化前提高了近3倍,且含量高于正交試驗組中最優試驗組合,因此確定發酵最優組合為A1B2C3D2。即菌株發酵培養基為:葡萄糖15 g/L,酵母粉10 g/L,牛肉膏15 g/L,L-谷氨酸鈉1.5%,乙酸鈉5.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO40.25 g/L、K2HPO42.0 g/L,吐溫-80 1.0 mL/L;發酵條件為:接種量4%,初始pH6.0,發酵溫度37 ℃,發酵時間48 h。

表4 正交試驗驗證結果

3 結論

γ-氨基丁酸是哺乳動物中樞神經系統中很重要的抑制性神經遞質,對人體健康具有重要的生理功能。GABA作為一種生物活性物質,已成為現在研究中的一個熱點[31]。關于產GABA乳酸菌的研究很多,因乳酸菌菌株來源、生長特性及發酵條件等的不同,其GABA產量也有所差異。龔福明等[32]在最佳發酵工藝條件下L.plantarumYM-4-3菌株發酵液中GABA含量可高達15.09 mmol/L。曾林等[33]以四川泡菜為分離源,分離具有產GABA能力的植物乳桿菌BC114,產GABA能力達到3.82 g/L,較優化前提高了2.22倍。本研究從傳統發酵食品中分離篩選產GABA的乳酸菌菌株,并對高產菌株進行菌種鑒定。結果表明:試驗篩選得到一株高產GABA菌株14#,其GABA含量為2.30 g/L,經生理生化鑒定及16S rDNA序列分析,鑒定菌株14#為植物乳桿菌。該菌株生長快,繁殖能力強,在優化條件下能高效生產GABA,其產量為9.12 g/L,比優化前提高了近3倍,是一株高產GABA的潛在菌株。為進一步提高GABA產量,可通過誘變[34-35]、生物轉化[36]、菌株改造[37-38]等來提升所篩菌株產GABA的能力,將GABA乳酸菌真正應用于食品、醫藥等工業生產中,發揮其功能特性,課題組未來的工作將致力于該方面研究。