定量代謝物組學研究硫酸銨添加對高產紅色糖多孢菌生理代謝的影響

徐 峰,原玉潔,黃明志,儲 炬

(華東理工大學生物工程學院生物反應器國家重點實驗室,上海 200237)

紅霉素是由紅色糖多孢菌產生的一類大環內酯類抗生素,其抗菌譜與青霉素G相似,但比青霉素寬[1-3]。紅霉素主要結合致病微生物的核糖體50S亞基,影響其蛋白質合成,限制微生物的生長以達到抑菌作用[4-5]。根據側鏈的結構,主要分為紅霉素A(Er-A)、紅霉素B(Er-B)、紅霉素C(Er-C)和紅霉素D(Er-D)。最有效和臨床上最重要的成分是紅霉素A[6-7],其余成分以Er-A的生物合成途徑中的中間體形式存在。因此,在發酵階段,可以通過提高Er-A的產量,減少其他副產物的生成,以降低生產成本和工業廢料。

微生物代謝物組(metabolomics)研究的主要內容是通過對微生物在一定培養條件下的胞內和胞外大部分代謝物進行定性和定量分析,來解釋微生物的一些代謝特征[12]。通過對胞內代謝物濃度水平進行分析可以找到代謝網絡中的限制因素。同位素稀釋質譜法(IDMS)已廣泛應用于代謝物組學研究[13-15]。其中用全標記13C代謝物作為內標的方法被稱為13C同位素稀釋質譜法(13C IDMS)。13C IDMS方法還能避免傳統胞內代謝物測定過程中對整個過程中每個步驟的回收率的評估。研究人員通過代謝組學研究發現一些難以達到平衡的反應,如磷酸果糖激酶催化的反應和丙酮酸激酶催化的反應是糖酵解途徑的主要調控步驟[16]。但是,利用代謝物組學研究抗生素合成過程中氮源對胞內中心碳代謝影響的報道較少。深入了解紅霉素工業生產菌的代謝特性,使培養工藝與細胞代謝相互適配,是提高紅霉素產量、降低生產成本,從而讓企業具備競爭力的關鍵。

本研究將基于13C輔助的定量代謝物組學技術用于考察硫酸銨添加對高產紅色糖多孢菌生理代謝的影響,并探討了硫酸銨添加后細胞生理代謝變化的調控機理,以期利用代謝物組學分析尋找紅霉素合成中的代謝瓶頸,實現針對性補料,進一步提高底物利用效率，降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅色糖多孢菌S.erythraea(Saccharopolysporaerythraea)E3-ΔsucC菌株 該菌株是對S.erythraeaE3菌株進行單交換敲除基因sucC(SACE_6669)得到,具有抗性篩選標記阿泊拉菌素Aprr、硫鏈絲菌素Tsrr,該菌株保藏在本實驗室菌種庫;淀粉、玉米漿、氯化鈉、硫酸銨、瓊脂、碳酸鈣、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氯化鈷、硼酸鈉、三氯化鐵、氯化銅、鉬酸銨 分析純,凌峰化學試劑有限公司(上海);丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、絲氨酸 分析純,泰坦科技股份有限公司(上海);衍生劑、乙腈 質譜純,阿拉丁生化科技股份有限公司(上海)。

SPY50回轉式搖床 離心機械研究所(上海);LGJ-10D冷凍干燥機 慕泓真空設備有限公司(上海);RapidVap真空旋轉蒸發儀 LABCONCO公司(美國);TGL-16A臺式高速離心機 悅豐儀器儀表有限公司;FE20 pH電極 Mettler Toledo儀器;InPro6800溶氧電極 Mettler Toledo儀器;5 L發酵罐 國強生化工程裝備有限公司(上海);Agilent 1100 series 高效液相色譜 Agilent公司(美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 平板培養基:淀粉10 g/L、玉米漿13 g/L、NaCl 3 g/L、(NH4)2SO43 g/L、瓊脂20 g/L、CaCO33 g/L,pH7.0,121 ℃滅菌20 min[17]。

搖瓶培養基:淀粉40 g/L、蛋白胨20 g/L、NaCl 4 g/L、KH2PO40.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、CaCO31.5 g/L,pH7.0,121 ℃滅菌20 min;葡萄糖10 g/L單獨于115 ℃滅菌20 min[17]。

發酵合成培養基:K2HPO41.28 g/L、KH2PO40.64 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、丙氨酸0.86 g/L、精氨酸0.68 g/L、半胱氨酸0.78 g/L、絲氨酸0.73 g/L、CoCl2·6H2O 0.009 g/L、Na3BO30.06 g/L、FeCl30.0068 g/L、CuCl20.00027 g/L、(NH4)2MoO40.00027 g/L,pH7.0,121 ℃滅菌20 min;葡萄糖22 g/L單獨于115 ℃滅菌20 min[17]。

1.2.2 培養方法 平板種子培養:在倒平板之前,向平板培養基中加入抗生素阿泊拉霉素(濃度為50 μg/mL)和硫鏈絲霉素(濃度為100 μg/mL)。之后用接種環從保存有高產紅色糖多孢菌E3-ΔsucC的甘油管中蘸取菌種,均勻涂布于平板上,放置在34 ℃恒溫培養箱中培養7 d。待菌落均勻分布于平板上且呈灰白色時進行下一步培養。

搖瓶種子培養:在平板上挖取1 cm2攜帶有菌種的小塊,并接種至錐形瓶中,再倒入5 mL葡萄糖溶液,轉速為220 r/min,34 ℃培養48 h。

5 L發酵罐培養:用滅菌的生理鹽水清洗種子液,首先將種子液在4000 r/min條件下離心5 min,然后倒出上清液,此時倒入30 mL滅好菌的生理鹽水,反復振蕩重懸菌體,然后在4000 r/min條件下離心5 min,將上清倒出,重復上述操作兩次,之后再分別向離心管中倒入50 mL滅過菌的去離子水,振蕩重懸菌體得到菌懸液,接種量為10%?；鹧嫒臃N法將菌懸液、葡萄糖和微量元素倒入5 L發酵罐中,裝液量為3 L,并設置好通氣量3000 mL/min和轉速400 r/min、發酵溫度34 ℃,之后維持整個發酵過程中的溶氧水平大于30%。發酵至60 h后,添加10 g/L葡萄糖和按0.01 g·(L·h)-1流加硫酸銨。其余發酵條件一致。整個發酵過程通過biostar軟件采集溶氧、pH、OUR、CER、通氣量、轉速、溫度等在線參數。

1.2.3 檢測方法

1.2.3.1 菌體干重 取5 mL發酵液,將菌懸液倒入事先稱量好的濾紙上,用抽濾裝置進行抽濾。將過濾后的濾紙放入80 ℃的烘箱中放置24 h。稱出帶有菌體的濾紙重量,計算出菌體干重DCW[18]。按照公式(1)計算比生長速率。

式(1)

其中,X表示菌濃,g/L;t表示時間,h;μ表示比生長速率,h-1。

1.2.3.2 葡萄糖濃度測定 使用DNS比色法進行測定[19]。按照公式(2)計算比葡萄糖消耗速率。

式(2)

其中,X表示菌濃,g/L;S表示底物濃度,g/L;μ表示比生長速率,h-1;qS表示底物比消耗速率,mmol/L/h。

1.2.3.3 紅霉素效價測定 采用磷酸分光光度法進行檢測[20]。采用磷酸水解法，即紅霉素經過磷酸水解后生成黃色物質，該物質于483 nm處有極大吸收值。

按照公式(3)計算比紅霉素速率。

式(3)

其中,X表示菌濃,g/L;P表示產物濃度μg/mL;μ表示比生長速率,h-1;qP表示產物比合成速率,mmol/L/h。

1.2.3.4 發酵過程尾氣氧氣和二氧化碳組分含量的測定 使用過程質譜儀(MAX300-LG,Extrel,USA)測定廢氣中氧氣和二氧化碳的體積分數。使用Parekh等[22]描述的方法在線計算氧消耗速率(OUR)和二氧化碳合成速率(CER)。OUR(Oxygen Uptake Rate)是指單位時間、單位體積發酵液細胞消耗的氧量,CER(Carbon-dioxide Escape Rate)是指單位時間、單位體積發酵液細胞釋放的二氧化碳量。按照公式(4)計算比氧氣消耗速率和比二氧化碳合成速率。

式(4)

式(5)

其中,X表示菌濃,g/L;OUR表示氧消耗速率mmol/L/h;CER表示二氧化碳合成速率mmol/L/h;qO2表示比氧氣消耗速率,mmol/g/h;qCO2表示比二氧化碳合成速率,mmol/g/h。

1.2.3.5 紅霉素各組分測定 通過高效液相色譜檢測紅霉素各組分含量。檢測條件:色譜柱采用Water XBridge C18柱,4.6 mm×250 mm,5 μm(Water Corporation,Ireland);流動相為0.025 mol/L的磷酸氫二鉀緩沖液∶乙腈=60∶40;在流速為0.9 mL/min、柱溫為35 ℃、檢測器為紫外光檢測器、且檢測波長為215 nm、進樣量為20 μL條件下進行紅霉素各組分測定。

1.2.3.6 有機酸與氨基酸類的測定 樣品前處理:取樣5 mL,用抽濾瓶過濾。然后用15 mL去離子水清洗3次,然后將濾紙投入含有20 mL液氮的50 mL離心管中。

沸乙醇提取:向樣品中加入25 mL煮沸的75%乙醇;然后在沸水浴中提取5 min;接著在振蕩器上振蕩30 s;接著將樣品在8000 r/min,室溫條件下離心5 min,將上清液通過0.45 μm的水相濾頭;然后將上清液轉入旋轉蒸發儀(真空度為10 Pa,轉速為50 r/min,溫度為40 ℃)蒸發至底部有少許殘余;接著用300 μL去離子水溶解樣品;最后用0.22 μm濾頭過濾后轉入樣品瓶。

衍生:吸取100 μL待測樣品到內襯管中,加入20 μL13C內標,內襯管置于進樣瓶(GC-vials)中用兩層保護膜包好。將所有樣品放入-80 ℃冰箱冷凍30 min,將樣品放入冷凍干燥機(真空度為10 Pa,冷凝溫度為-60 ℃),抽干過夜,準備衍生。在通風櫥中先取75 μL乙腈(或新配制的甲氧胺吡啶)到各內襯管中,再加入75 μL N-(特丁基二甲基硅烷)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA);蓋好蓋子,放入70 ℃烘箱靜置60 min;待樣品冷卻至室溫后,將內襯管轉移至1.3 mL離心管中,12000 r/min離心3 min;最后將上清液轉移至干凈的內襯管中,放到GC-vials中,準備進樣。

GC-MS參數設置為:氣相毛細管柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)(Agilent,America),進樣量為1 μL,柱溫為280 ℃,分流比為不分流,載氣為氦氣,載氣流速為1 mL/min,傳輸線溫度為250 ℃,離子源溫度為230 ℃,四級桿溫度為150 ℃,溫度梯度設置為100 ℃保持1 min,然后10 min內以10 ℃/min的速度升至320 ℃。檢測方法:全掃描模式。

根據無干擾且信號強的原則,選取的氨基酸碎片如表1所示。采用這些碎片進行同位素信息分析可以避免干擾,并能提高檢測的靈敏度。

表1 采用GC-MS分析氨基酸同位素信息過程中所選取的碎片

1.3 數據處理

所有實驗均重復三次,數據處理軟件、數據分析軟件、繪圖軟件采用Microsoft Excel 2019進行編輯。

2 結果與分析

2.1 硫酸銨添加對菌體表觀生理參數影響

高產紅色糖多孢菌在補料分批發酵過程后期添加硫酸銨對菌體表觀生理參數的影響如圖1所示。高產紅色糖多孢菌發酵過程分為兩個階段,菌體生長期(12～48 h)和紅霉素合成期(48～144 h),培養前12 h,菌體處于延滯期;12～48 h,菌體開始大量合成,菌體干重由1.1 g/L增長至8.4 g/L。48 h之后,菌體量開始逐漸下降,紅霉素開始大量合成。在60 h添加硫酸銨后,菌濃于132 h后開始大量減少,而對照組則在72 h后明顯下降。最終紅霉素效價從830 μg/mL提高至1126 μg/mL。0～48 h、0～36 h,比二氧化碳合成速率與比氧氣消耗速率分別呈現上升趨勢,由0.7、0.9 μmol/L/h分別增長至1.8、2.4 μmol/L/h,說明該階段菌體呼吸代謝旺盛。48 h之后兩組實驗的比二氧化碳合成速率與比氧氣消耗速率均開始下降,60 h添加硫酸銨后出現二次上升,表明菌體代謝活性可能得到提高。高產紅色糖多孢菌在60～144 h期間,其比紅霉素合成速率和比葡萄糖消耗速率均一直在降低,但在添加硫酸銨后其比紅霉素合成速率和比葡萄糖消耗速率分別比對照組提高了30.0%、47.2%。基于發酵過程中各參數間相關性分析,硫酸銨添加后各比速率水平提高,表明氮源的添加與菌體的生長過程耦合,未添加硫酸銨的批次在紅霉素合成期可能出現菌體自溶現象,分析菌濃開始大量下降可能是氮源不足所致。

圖1 5 L罐中添加硫酸銨與未添加硫酸銨表觀生理參數

2.2 硫酸銨添加對紅霉素組分的影響

如表2所示,與對照組相比,發酵60 h補加硫酸銨后,在不同時間點測定紅霉素各組分濃度,結果發現添加硫酸銨后不僅紅霉素A組分的比例從802.9 μg/mL提高到956.1 μg/mL,紅霉素C的轉化率在96 h達到99.2%,而對照組最高為84.1%。而且隨著添加硫酸銨時間的變化(120～144 h),紅霉素A組分濃度維持在一個較高的水平99.0%,對照組則呈現一個下降的趨勢(由84.1%降到81.4%)。紅霉素A的生物合成過程主要是6-脫氧紅霉內酯的形成和后修飾形成紅霉素D,然后紅霉素D先在大環內酯12位碳原子上先羥基化形成紅霉素C,再通過甲基化形成紅霉素A[1]。添加硫酸銨后,紅霉素A組分的變化非常顯著(98.7%～99.2%),而對照組的紅霉素A比例則相對較低(81.4%～84.1%),紅霉素A組分的提高說明添加硫酸銨可能提高了紅霉素C的甲基化過程。

表2 高產紅色糖多孢菌未添加與添加硫酸銨實驗紅霉素各組分濃度

2.3 硫酸銨添加對胞內代謝物的影響

圖2 5 L罐中胞內有機酸濃度隨時間變化趨勢

圖3 5 L罐中胞內菌體合成前體氨基酸濃度隨時間變化趨勢

圖4 5 L罐中胞內紅霉素合成前體氨基酸濃度隨時間變化趨勢

圖3表示添加硫酸銨對高產紅色糖多孢菌發酵后期菌體合成前體類氨基酸的影響,添加硫酸銨后,脯氨酸濃度從0.53 μmol/g DCW提高到0.85 μmol/g DCW,絲氨酸濃度從0.20 μmol/g DCW提高到0.38 μmol/g DCW,谷氨酰胺濃度從0.94 μmol/g DCW提高到1.52 μmol/g DCW,這些氨基酸濃度的提高有利于補充菌體合成所需的前體物質,表明添加硫酸銨對菌體生長有促進作用。圖4表示添加硫酸銨對高產紅色糖多孢菌發酵后期紅霉素合成前體類氨基酸的影響,其中丙酰輔酶A類合成前體包括天冬氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸。60 h添加硫酸銨后,天冬氨酸濃度從0.48 μmol/g DCW提高到1.46 μmol/g DCW,蘇氨酸濃度從0.05 μmol/g DCW提高到0.08 μmol/g DCW,異亮氨酸濃度從0.45 μmol/g DCW提高到0.93 μmol/g DCW,這些氨基酸濃度的提高有利于紅霉素合成所需的前體供應,表明發酵后期添加硫酸銨不僅可以提高菌體的初級代謝,也能改善菌體的次級代謝。

3 討論

紅霉素是我國目前年產量達萬噸的抗生素產品之一,隨著不斷拓寬的臨床用途和新一代半合成紅霉素的開發,紅霉素的需求和應用市場日趨活躍。對于紅霉素氮源調控及相關研究中,Zou等[11]、Chen等[24]報道了氮源添加種類、氮源添加比例以及氮源磷源共調節等對紅霉素發酵過程的影響,表明氮源對提高紅霉素發酵單位有顯著的提高。在本研究中,添加硫酸銨后最終紅霉素效價從830 μg/mL提高至1126 μg/mL。

在紅霉素發酵過程中,雜質組分Er-C向有效組分Er-A的轉化過程也受到工藝條件的影響,李嘯等以促進甲基化反應和強化基礎代謝為主要手段,在發酵后期127 h,向發酵液中流加ATP、L-Met、MgSO4和檸檬酸,Er-A的比例由原來的73%提高到88%以上[25]。呂偉等在搖瓶培養過程初始添加0.05%的甘氨酸,紅霉素產量明顯提高(72.2%),Er-A組分相對百分含量提高9.7%,Er-C組分減少78.7%,在50 L發酵罐驗證結果紅霉素產量達到8939 U/ml,比對照提高12.2%,Er-A:Er-C從5.1∶1提高到8.2∶1[26]。pH控制發酵是提高紅霉素A合成的有效手段,Elmahdi等報道在恒pH7.0條件下,Er-A∶Er-C組分從2∶1提高到11∶1,而Er-B組分未檢測出,說明pH環境控制對Er-C轉化Er-A組分中兩個關鍵酶EryG和EryK的活性都有顯著的影響[27]。李楨林等[28]在利用必特螺旋霉素基因工程發酵生產必特螺旋霉素,也發現過程補加銨離子也明顯改善必特螺旋霉素組分。

圖5 紅霉素C轉化成紅霉素A的過程

胞內氨基酸是菌體蛋白和紅霉素前體合成的重要物質,因此胞內氨基酸濃度水平對于了解發酵后期菌體蛋白合成與紅霉素前體供應過程中的代謝特征具有重要意義。紅霉素合成前體主要由丙酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A所組成,其中丙酰輔酶A合成的主要來源則主要為轉氨后的碳骨架與部分短鏈脂肪酸[29-30],另外部分分支氨基酸也可以在胞內轉化成丙酰輔酶A。Hong等[31]利用同位素標記實驗發現脯氨酸能夠進入TCA循環通過分解代謝提供能量和輔因子,同時脯氨酸也可直接用于合成紅色糖多孢菌。另外,硫酸銨進入TCA循環促進α-酮戊二酸轉化成谷氨酸,然后通過轉氨作用使得胞內谷氨酸水平下降,合成大量的谷氨酰胺,從而進一步促進菌體生長。該結果也同時表明添加硫酸銨在紅霉素的生產過程中具有巨大潛力。在進一步的研究過程中,可以通過發酵調控來維持高產紅色糖多孢菌較高的比紅霉素合成速率,有望極大提高工業紅霉素的產量。

4 結論

本研究將基于13C輔助的定量代謝物組學技術用于考察硫酸銨添加對高產紅色糖多孢菌生理代謝的影響,并探討了硫酸銨添加后細胞生理代謝變化的調控機理。表觀生理代謝參數表明于60 h開始添加硫酸銨后菌體代謝活性得到提高,最終紅霉素效價從830 μg/mL提高至1126 μg/mL,紅霉素A組分的比例從802.9 μg/mL提高到956.1 μg/mL,紅霉素C的轉化率在96 h達到99.2%。定量代謝物組學結果表明添加硫酸銨后胞內有機酸水平差異明顯,其中α-酮戊二酸濃度的降低(4.15 μmol/g DCW降到1.05 μmol/gDCW)有利于菌體的生長維持。對于胞內氨基酸水平而言,添加硫酸銨后,胞內菌體合成前體類和紅霉素合成前體類氨基酸均有所提高,如脯氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸分別提高了60.4%、90.0%、204.2%、106.7%,表明添加硫酸銨之后不僅能夠促進高產紅色糖多孢菌的初級代謝，也在一定程度上刺激了次級代謝的提高。