超微冷凍粉碎處理下酸棗仁蛋白提取工藝優化

譚力銘,裴海生,趙丹丹,胡高爽,郝建雄,*,張敬軒

(1.河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050000;2.農業農村部規劃設計研究院,北京 100121;3.河北省食品質量與安全檢測技術創新中心,河北石家莊 050000)

酸棗仁(ZiziphusjujubaMill.var.spinosa)為鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子,采收成熟酸棗,除去果肉,碾碎果核,取出種子,曬干而成[1]。酸棗的產地主要位于河北、河南、陜西、內蒙古等地。酸棗仁被認定為藥食同源食品,其中蛋白質含量約為36%,并含有三萜類、甾醇、酸棗仁皂甙等多種功能性物質[2],營養價值較高。酸棗仁有鎮靜、催眠、鎮痛、斂汗、降壓作用[3]。目前對于酸棗仁的研究主要集中于黃酮、皂苷和生物堿等成分以及藥理作用[4]。

超微粉碎技術是近年來國際上一種較為成熟的新型食品加工技術,應用領域較為廣泛。超微粉碎技術不同于以往的常規機械粉碎,其特點是使物料快速、高效、瞬時地完成粉碎,更好地保持物料原有的理化性質和活性成分[5],同時顆粒的細微程度使得物料的孔隙率和表面積有所改變,從而使物料具有良好的吸附性、比表面積、溶解性、粒徑均勻[6-7]。劉彩兵等[8]通過對米糠的粗粉碎和沖擊粉碎對比,發現沖擊粉碎的米糠中蛋白質、氨基酸等含量有較大增加,且超微粉顆粒分散度高、粒徑均勻。司玉慧[9]研究不同超微粉碎方法對大豆分離蛋白功能特性的影響,發現超微粉碎可以使粉體顆粒比表面積增大、粒徑減小,粉體峰值溫度升高,熱焓值降低,說明此時樣品中蛋白質已一定程度伸展。冷凍粉碎技術是目前比較流行的一種技術,在國內外應用十分廣泛。低溫冷凍可以較完整的保留食品的色、香、味以及活性物質[10-11],冷凍粉碎可以極大地保留食品的營養成分和活性成分[12],避免物料在高轉速粉碎條件下產熱而導致氧化、分解、變色、變性[13],使常溫條件下難以粉碎的物料得到充分粉碎,同時利用超低溫脆性使得物料粉碎達到更細微的程度。Bellik等[13]通過對比普通研磨和低溫研磨對提取香茅葉中揮發性油的影響,發現低溫研磨可以顯著提高揮發性油的提取率,且主要成分和化學類別存在變化。

關于酸棗仁蛋白提取,前人大多集中于普通粉碎方法-常規機械粉碎,普通粉碎方法的缺陷在于使酸棗仁蛋白微觀結構未完全打開,導致蛋白提取率不理想[14]。本研究以酸棗仁渣為原料,經超微冷凍粉碎、脫脂得到的脫脂酸棗仁粉作為研究對象，通過單因素實驗及響應面分析,建立酸棗仁蛋白提取率的數學模型,對其酸棗仁蛋白提取工藝進行研究,旨在為酸棗仁蛋白的提取工藝奠定一定的理論基礎,為酸棗加工副產物再利用提供一個新的開發方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁渣 河北省邢臺市潤玉食品有限公司提供;牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250 生化純,北京奧博星生物技術有限公司;鹽酸、氫氧化鈉 分析純,天津市永大化學試劑有限公司;石油醚 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;HC-3018高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;RT-25型氣流式超微粉碎機 榮聰精密科技有限公司;LGJ-10D型冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司;SPECTRO star Nano酶標儀 德國BMG LABTECH公司;ST2100實驗室pH計 奧豪斯儀器(常州)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸棗仁渣前處理 普通粉碎:取200 g酸棗仁渣放入粉碎機,粉碎1 min,過80目篩,收集密封放入4 ℃冰箱備用。

超微冷凍粉碎:取200 g酸棗仁渣以液氮為冷源通入粉碎機,打粉1 min,過80目篩。將粗粉碎的酸棗仁渣放入氣流式超微粉碎機,以液氮為冷源通入超微粉碎機,電流設置5 A,粉碎1 min,過150目篩,收集密封放入4 ℃冰箱備用。

1.2.2 脫脂酸棗仁粉的制備 將粉碎好的酸棗仁粉與石油醚按料液比1∶3 (g/mL),50 ℃水浴浸提30 min,離心(4000 r/min、10 min)去除上清液,重復多次,直到上清液完全澄清透明,室溫通風12 h,40 ℃干燥12 h,得到脫脂酸棗仁粉,收集密封放入-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 脫脂酸棗仁蛋白質含量測定 參照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質的測定》(凱氏定氮法)[15]。

1.2.4 酸棗仁蛋白的制備 參考趙杰昌[16]的方法,略有改進。稱取1 g脫脂酸棗仁粉,按比例溶解于蒸餾水中,調節溶液一定pH,在一定溫度下水浴攪拌浸提一定時間,離心(5000 r/min、20 min)得上清液,調節溶液值至酸棗仁蛋白等電點,4 ℃靜置2 h,離心得到酸棗仁蛋白沉淀,冷凍干燥得到酸棗仁蛋白。酸棗仁蛋白提取率計算:

式中:W表示酸棗仁蛋白提取率,%;m表示提取得到的蛋白質量,g;M表示脫脂酸棗仁粉中蛋白質量,g。

1.2.5 酸棗仁蛋白等電點的測定 稱取一定脫脂酸棗仁粉,按液料比30∶1 (mL/g)溶解于蒸餾水中、pH10.0、55 ℃攪拌浸提50 min,離心(5000 r/min、20 min)得上清液,分兩組用1 mol/L鹽酸調節上清液pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8,4 ℃靜置2 h后離心(5000 r/min、15 min),通過考馬斯亮藍法分別測定酸沉前和酸沉后上清液中酸棗仁蛋白的質量。酸棗仁蛋白的沉淀率計算:

式中:P表示酸棗仁蛋白沉淀率,%;m1表示酸沉前上清液中蛋白質質量,g;m2表示酸沉后上清液中蛋白質質量,g。

1.2.6 單因素實驗 對于堿溶酸沉法提取蛋白質,考察液料比、pH、提取溫度、提取時間四個因素對酸棗仁蛋白提取率的影響,按1.2.4酸棗仁蛋白制備方法,并設置重復試驗。按液料比(mL/g)15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1,pH10,提取溫度55 ℃,提取時間50 min進行實驗;按pH8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,液料比30∶1,提取溫度55 ℃,提取時間50 min進行實驗;按提取溫度45、50、55、60、65 ℃,液料比30∶1,pH10,提取時間50 min進行實驗;按提取時間30、40、50、60、70 min,液料比30∶1,pH10,提取溫度50 ℃進行實驗。

1.2.7 響應面試驗 基于單因素實驗基礎上,采用Box-Behnken原理設計試驗方案,以液料比(A)、pH(B)、溫度(C)、時間(D)為影響因素,酸棗仁蛋白提取率(R1)為響應值,試驗因素及水平因素編碼見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

1.3 數據處理

所有試驗均重復3次,試驗結果用平均值±標準差表示,使用Origin Pro 8.0、SPSS Statistics 22.0和Design-Expert11對試驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 普通粉碎與超微冷凍粉碎對酸棗仁蛋白提取率影響

以液料比(mL/g)30∶1、pH10、提取溫度55 ℃、提取時間50 min為提取條件,經3次驗證性試驗,普通粉碎方法的酸棗仁蛋白平均提取率為69.71%±0.21%,經過超微冷凍粉碎的酸棗仁蛋白平均提取率為76.56%±0.30%,主要因為超微粉碎可以破壞物料細胞結構,使蛋白等內容物的比表面積增大,粒度較小且均勻[5,17-18],從而促進蛋白在堿液中的溶解度,使得蛋白提取率提高。同時冷凍粉碎使蛋白活性保持較好且使物料產生脆性,有利于破壞細胞結構,所以超微冷凍粉碎方法可以顯著提高蛋白提取率。雖然此方法復雜且投資較大,但由于蛋白類物質容易變性失活,為保證提取工藝的可重復性和準確性,同時保證工作的高效進行,采用既能大量提取蛋白又能保證蛋白活性的超微冷凍粉碎法是較為理想的提取方式。

2.2 脫脂酸棗仁中蛋白質含量及酸棗仁蛋白等電點的測定

經凱氏定氮法測定脫脂酸棗仁蛋白質含量為(73.42±0.23) g/100 g,蛋白質含量較高,由此得出該原料開展后續酸棗仁蛋白提取工藝研究具有實際意義。

由圖1可以看出,蛋白沉淀率隨著pH的升高而增大,在pH為4.5的附近達到最大值,之后隨著pH的繼續升高而緩慢減小。因此酸棗仁蛋白等電點為pH4.5左右。這是因為酸棗仁蛋白溶液在等電點時,其分子以兩性離子的形式存在,正負離子在溶液中不斷溶解和溶出,但此時的正負離子數相等[19],其溶解度最小,最易形成蛋白質沉淀[20]。從圖2可以更準確地看出,酸棗仁蛋白沉淀率在pH為4.6時達到最大值,即酸棗仁蛋白等電點為pH4.6,為后續工藝優化提供試驗參數。

圖1 酸棗仁蛋白等電點(pH3.0～6.0)

圖2 酸棗仁蛋白等電點(pH4.3～4.8)

2.3 單因素實驗

2.3.1 液料比對酸棗仁蛋白提取率的影響 由圖3可知,液料比(mL/g)在15∶1～30∶1之間,蛋白提取率隨液料比的增加而逐漸升高,主要原因是因為隨著液料比的增大溶液的黏度隨之減小,分子的擴散速率增大[21],酸棗仁蛋白充分溶解于溶劑中,從而使酸棗仁蛋白的提取率升高,當液料比超過30∶1 (mL/g)后,酸棗仁蛋白提取率逐漸減小,且由于液料比過高導致浪費程度加大,不利于工業化生產,故選較優液料比為30∶1 (mL/g)。

圖3 液料比對酸棗仁蛋白提取率的影響

2.3.2 pH對酸棗仁蛋白提取率的影響 由圖4可知,pH在8～11之間時,蛋白提取率隨pH的增大而增加,主要原因是因為蛋白在弱堿性條件下,酸棗仁蛋白在溶劑中的溶解性較好、分散性好[22]。而當隨著pH升高并到達一定值時,會導致酸棗仁蛋白天然結構的改變,使得在溶劑中的溶解度下降,并會引起酸棗仁蛋白功能活性降低[23],故選較優pH為11。

圖4 pH對酸棗仁蛋白提取率的影響

2.3.3 提取溫度對酸棗仁蛋白提取率的影響 由圖5可知,當提取溫度在45～50 ℃之間時,酸棗仁蛋白的提取率隨溫度的升高而增大,主要原因是因為當溫度升高,溶液黏度降低,體系分散度升高,使得酸棗仁蛋白溶解度提高[16],蛋白提取率隨之升高。當溫度高于50 ℃后,蛋白提取率隨著溫度的升高而逐漸降低并趨于平緩,是因為溫度過高導致酸棗仁蛋白變性,從而降低其在溶劑中的溶解度,導致蛋白提取率降低,故可以得出,提取溫度不宜過高,因此選取較優溫度值為50 ℃。

圖5 提取溫度比對酸棗仁蛋白提取率的影響

2.3.4 提取時間對酸棗仁蛋白提取率的影響 由圖6可知,提取時間在30～60 min之間時,蛋白提取率隨提取時間的升高而增大,而當提取時間超過60 min后,蛋白提取率隨提取時間的升高而減小,主要原因可能是因為隨著提取時間的增大,酸棗仁蛋白得到充分的溶解,當溶解度達到一定值時,酸棗仁蛋白在溶劑中的溶出率達到動態平衡[24],且由于過長時間的受熱導致蛋白質部分發生變性,降低酸棗仁蛋白在溶劑中的溶解度。由于50與60 min無顯著性差異,且50與40、70 min無顯著性差異,但60與40、70 min存在顯著性差異,故選擇60 min較為合適,50與60 min兩組誤差線相比,60 min數據更為準確,故選擇較優提取時間為60 min。

圖6 提取時間對酸棗仁蛋白提取率的影響

2.4 響應面試驗結果

在單因素實驗的基礎上,根據Box-Behnken試驗設計原理,確定4因素3水平的響應面分析方法,酸棗仁蛋白提取響應面試驗設計與結果見表2。

表2 試驗設計與結果

2.4.1 回歸模型建立與方差分析 通過表2試驗數據,得到酸棗仁蛋白提取率(R1)與液料比(A)、pH(B)、提取溫度(C)和提取時間(D)的回歸方程:

R1=77.93+1.18A+1.61B+0.2151C-0.2889D-0.5021AB+0.6603AC+0.342AD-0.5193BC-0.2830BD-0.1181CD-1.41A2-1.84B2-0.8083C2-0.8269D2,對該回歸方程進行方差分析,結果見表3。

表3 回歸模型方差分析

圖7 液料比與pH的交互作用對酸棗仁蛋白提取率影響的響應面及等高線圖

該模型的F=60.89,P<0.0001差異極顯著,且失擬項P=0.0871>0.05,不顯著,決定系數R2為0.9838,說明回歸方程擬合度和可信度很高,可用于范圍內預測。由表3回歸模型系數的顯著性分析,將不顯著項剔除,簡化后的回歸方程為:

R1=77.93+1.18A+1.61B+0.2151C-0.2889D-0.5021AB+0.6603AC+0.342AD-0.5193BC-1.41A2-1.84B2-0.8083C2-0.8269D2

分析對比一次項的F值,得出4個單因素對酸棗仁蛋白提取率影響大小順序為:C0.05)。而模型的二次項的影響均極顯著(P<0.01)。

2.4.2 響應面分析 經Deign-Expert 11軟件處理,得到液料比(A)、pH(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)交互作用的響應面及等高線圖。

如圖7～圖10所示,酸棗仁蛋白提取率隨著液料比、pH、提取溫度和提取時間的升高,蛋白提取率都出現先升高后減小的趨勢,可以推斷出獲得較高蛋白提取率,液料比應在30∶1～32.5∶1 (mL/g)之間,pH應在11.5附近,提取溫度應在50 ℃左右,提取時間應在60 min附近。

圖8 液料比與提取溫度的交互作用對酸棗仁蛋白提取率影響的響應面及等高線圖

圖9 液料比與提取時間的交互作用對酸棗仁蛋白提取率影響的響應面及等高線圖

圖10 提取溫度與pH的交互作用對酸棗仁蛋白提取率影響的響應面及等高線圖

圖7的等高線圖則出現較完整的橢圓形,且響應面的曲面降幅較大、傘形明顯,表示AB的交互作用對蛋白提取率影響為極顯著;圖8和圖10的等高線圖呈較扁的橢圓形,即AC和BC的交互作用對蛋白提取率影響為極顯著;而圖9的等高線圖則出現較規則橢圓形[25],表示液料比與提取時間交互作用對蛋白提取率影響為顯著,此都與方差分析結果吻合。

由所得到的模型,經Design-Expert 11軟件處理得到蛋白提取率最高的相應各參數值為:液料比31.86∶1 (mL/g)、pH11.38、提取溫度50.87 ℃、提取時間58.24 min,最大理論蛋白提取率為78.50%。經過修正確定最終工藝參數為液料比32∶1 (mL/g)、pH11.4、提取溫度51 ℃、提取時間58 min。此條件下重復進行3次試驗,酸棗仁蛋白平均提取率為78.47%±0.17%,與理論值接近,表明該回歸模型對優化酸棗仁蛋白的提取工藝可行,可用于指導實際生產。

3 結論

在相同提取條件下,普通粉碎方法的酸棗仁蛋白平均提取率為69.71%±0.21%,經過超微冷凍粉碎的酸棗仁蛋白平均提取率為76.56%±0.30%,超微冷凍粉碎方法顯著提高了蛋白提取率(P<0.05)。由于蛋白類物質容易變性失活,為保證工廠工藝的可重復性和準確性,采用既能大量提取蛋白又能保證蛋白活性的超微冷凍粉碎法是較為理想的提取方式。

脫脂酸棗仁粉中蛋白質含量為(73.42±0.23) g/100 g,其中蛋白質含量較高,保留較好,酸棗仁蛋白等電點為pH4.6。

采用超微冷凍粉碎進行前處理,經Design-Expert 11軟件分析得出4個因素對蛋白提取率影響由大到小順序為:pH、液料比、提取時間、提取溫度。由得到的回歸模型對酸棗仁蛋白提取工藝進行優化,得出最佳提取工藝條件為液料比32∶1 (mL/g)、pH11.4、提取溫度51 ℃、提取時間58 min。在此條件下重復3組試驗,實際酸棗仁蛋白平均提取率為78.47%±0.17%,與理論值較為接近,表明該回歸模型對優化酸棗仁蛋白的提取工藝可行,可用于指導實際生產,相較前報道的酸棗仁蛋白提取工藝研究,蛋白提取率有明顯提高。