羅耳阿太菌多糖對Cu2+和Cd2+的吸附工藝優化及表征

劉玉琪,李鴻梅,范春婷,閔偉紅,高雅文

(吉林農業大學食品科學與工程學院,吉林長春 130118)

重金屬造成的水污染是近年來最大的環境問題之一,土壤、農業用水的重金屬污染尤為嚴重[1],它們可以積聚在動植物體內,通過食物鏈進入人體,對健康造成巨大的危害[2-3]。銅和鎘是廢水中最常見的兩種重金屬[4]。雖然銅是人體必需元素,但在體內過量積累也會帶來嚴重的毒理學問題,如嘔吐、痙攣、抽搐,甚至死亡[5]。鎘是目前廢水中發現毒性最大的重金屬,會對呼吸系統和生殖系統造成危害[6-7],也可導致骨骼軟化、肝中毒、肺癌等[8]。因此去除廢水中的重金屬成為近年來的研究熱點,目前去除銅、鎘的方法有化學沉淀、離子交換、生物吸附、膜過濾、電化學處理等[9-13],其中生物吸附是一種新型有效且經濟環保的方法,受到眾多學者關注[14]。

羅耳阿太菌多糖(Atheliarolfsiipolysaccharide,AEPS)是一種生物吸附劑,國內外學者研究表明,生物吸附可能是由靜電吸附、絡合、離子交換、表面沉淀[15]等引起的。2015年侯文潔[16]從苜蓿中華根瘤菌株中分離出胞外聚合物,發現銅離子主要以離子交換方式結合在胞外聚合物上。2018年Adam等[17]報道了從牛肝菌子實體中分離出堿性多糖,并通過吸附鉛和鎘離子試驗證實了這種多糖具有良好的生物吸附能力。同年田月月等[18]研究了水溶性大豆多糖對鉛離子的吸附,并通過動力學試驗推測大豆多糖分子鏈的羧基是與鉛離子吸附的主要基團。

本研究旨在采用正交試驗優化AEPS吸附銅離子和鎘離子,并通過掃描電子顯微鏡和X射線能譜儀及紅外光譜初步揭示AEPS吸附銅離子和鎘離子機理,為AEPS處理重金屬污染的食品工業和農業用水的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅耳阿太菌 吉林農業大學發酵工程實驗室提供;氯化鈉、五水硫酸銅、四水硝酸鎘、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚 均為國產分析純試劑;SephacrylTM S-400 High Resolution柱料 GE公司;超濾離心管(3000 Da) 美國Millipore公司。

電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司;UV-1700紫外可見光分光光度計、Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀、AA-6300原子吸收分光光度計 日本島津公司;低溫高速離心機 德國HERMLE公司;FD-1B-50冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;掃描電子顯微鏡、X-射線能譜儀 COXEM公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重金屬離子標準溶液的配制 Cu2+標準溶液:將3.9281 g CuSO4·5H2O溶于少量去離子水中,待完全溶解后,用容量瓶定容至1 L,得到Cu2+標準溶液(1 g/L),試驗中逐級稀釋使用。

Cd2+標準溶液:將2.7442 g Cd(NO3)2·4H2O溶于少量去離子水中,待完全溶解后,用容量瓶定容至1 L,得到Cd2+標準溶液(1 g/L),試驗中逐級稀釋使用。

1.2.2 羅耳阿太菌粗AEPS的提取與純化 羅耳阿太菌發酵培養后,取發酵液調節pH至7～8,恒溫80 ℃水浴30 min,冷卻后4 ℃,8000 r/min離心5 min,上清液木瓜蛋白酶法除蛋白后醇沉,透析后冷凍干燥,得到粗AEPS粉備用[19]。

采用Sephacryl S400-HR柱料進行純化,AEPS濃度1.5 g/L,上樣量5 mL,以0.9%(w/w)氯化鈉溶液洗脫5 h,流速0.5 mL/min。采用苯酚-硫酸法隔管檢測AEPS含量,收集純化后AEPS,濃縮透析冷凍干燥后用于后續分析[20]。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 pH對Cu2+和Cd2+吸附率的影響 Cu2+和Cd2+溶液濃度為0.2 g/L(用標準溶液稀釋得到),將AEPS溶液與等體積的重金屬離子溶液混勻,AEPS濃度為1.5 g/L,調節Cu2+溶液pH(1、2、3、4、5),Cd2+溶液pH(1、2、3、4、5、6、7、8),30 ℃反應60 min,反應結束后,置于超濾離心管中4500 r/min離心30 min,取上清液稀釋100倍后,采用火焰原子吸收法測定Cu2+和Cd2+殘留量,每組樣品3次平行。

1.2.3.2 AEPS初始濃度對Cu2+和Cd2+吸附率的影響 其他條件不變,Cu2+溶液pH為4,Cd2+溶液pH為6,AEPS溶液濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5 g/L,30 ℃反應60 min,每組樣品3次平行。

1.2.3.3 吸附溫度對Cu2+和Cd2+吸附率的影響 其他條件不變,AEPS濃度為1.5 g/L,Cu2+溶液pH為4,Cd2+溶液pH為6,在不同溫度下(20、30、40、50、60 ℃)反應60 min,每組樣品3次平行。

1.2.3.4 吸附時間對Cu2+和Cd2+吸附率的影響 其他條件不變,AEPS濃度為1.5 g/L,Cu2+溶液pH為4,Cd2+溶液pH為6,40 ℃反應15、30、45、60、75、90 min,每組樣品3次平行。

1.2.4 正交試驗 在單因素實驗的基礎上,選取pH、AEPS濃度、溫度、吸附時間為自變量，以Cu2+和Cd2+吸附率為因變量,進行正交試驗設計,確定AEPS吸附Cu2+和Cd2+的最優工藝條件。

表1 AEPS吸附Cu2+正交試驗設計

表2 AEPS吸附Cd2+正交試驗設計

1.2.5 吸附率的測定 銅離子和鎘離子殘留量采用《水和廢水監測分析方法》中直接吸入火焰原子吸收法檢測,吸附率按照以下公式進行計算。

式中:Y為重金屬離子吸附率,%;Ci為混合液中重金屬離子的初始濃度,g/L;Cf為混合液中重金屬離子的平衡濃度,g/L。

1.2.6 SEM和EDS分析 用導電膠粘合劑固定好吸附前后的AEPS,鍍上金粉,利用掃描電子顯微鏡和X-射線能譜分析儀對樣品進行掃描觀察[21]。

1.2.7 紅外光譜分析 KBr于150 ℃烘箱中干燥4 h,稱取1 mg吸附Cu2+和Cd2+前后的AEPS樣品分別與100 mg干燥后的KBr混合。將混合物精細研磨然后壓片。選定波長范圍在4000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1,光闌設置8 mm,描時間16 s,測紅外光譜[22]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 AEPS的純化

如圖1所示,AEPS經過Sephacryl S400-HR分離純化后,獲得兩個不同組分AEPSⅠ和AEPSⅡ,兩個組分呈現單一、尖銳、對稱峰型,且沒有拖尾現象,說明兩個組分較為專一。收集兩個組分多糖用于后續分析。

圖1 Sephacryl S400-HR洗脫曲線

2.2 單因素實驗結果

圖2 pH對Cu2+和Cd2+吸附率的影響

2.2.2 AEPS初始濃度對Cu2+和Cd2+吸附率的影響 由圖3可知,當AEPS初始濃度在0.5～1.5 g/L時,Cu2+和Cd2+吸附率隨著AEPS初始濃度的增加而增大,AEPS初始濃度在1.5 g/L時達到最大值,Cu2+為84.0%,Cd2+為75.52%,隨著AEPS初始濃度的繼續增大,Cu2+和Cd2+吸附率緩慢下降。AEPS初始濃度也是影響重金屬離子吸附的另一個重要條件,當AEPS濃度過低時,不能提供足夠的供金屬離子結合的位點,當濃度過高時,AEPS提供的吸附位點過飽和,但結合的重金屬離子不穩定,而且吸附劑單位質量吸附的重金屬離子減少[29],導致吸附率略有下降。因此,選擇AEPS初始濃度1.3、1.5、1.7 g/L為Cu2+和Cd2+吸附正交試驗的三個水平。

圖3 AEPS初始濃度對Cu2+和Cd2+吸附率的影響

2.2.3 吸附溫度對Cu2+和Cd2+吸附率的影響結果 由圖4可知,當吸附溫度在20～40 ℃時,Cu2+和Cd2+吸附率隨著吸附溫度的升高而增大,吸附溫度在40 ℃時達到最大值,Cu2+吸附率為86.72%,Cd2+吸附率為75.31%,隨著吸附溫度的繼續升高,Cu2+和Cd2+吸附率緩慢下降。這可能是由于溫度的升高使AEPS分子中部分官能團的鍵發生斷裂,AEPS的分子活性增強,重金屬離子之間的分子動能增加,吸附率升高。但溫度過高,AEPS生物活性會減弱,吸附率下降[30]。因此,選擇反應溫度35、40、45 ℃為Cu2+和Cd2+吸附正交試驗的三個水平。

圖4 吸附溫度對Cu2+和Cd2+吸附率的影響

2.2.4 吸附時間對Cu2+和Cd2+吸附率的影響結果 由圖5可知,當吸附時間在0～45 min時,Cu2+吸附率隨著吸附時間的增大而增大,吸附時間在45 min時達到最大值85.24%,隨著吸附時間的繼續增大,Cu2+吸附率輕微下降;當吸附時間在0～60 min時,Cd2+吸附率隨著吸附時間的增大而增大,吸附時間在60 min時達到最大值75.09%,隨著吸附時間的繼續增大,Cd2+吸附率緩慢下降。因此,選擇時間40、45、50 min為Cu2+吸附正交試驗的三個水平,選擇時間55、60、65 min為Cd2+吸附正交試驗的三個水平。

圖5 吸附時間對Cu2+和Cd2+吸附率的影響

2.3 正交試驗優化

如表3所示,通過極差分析可知A、B、C、D四個因素影響AEPS吸附Cu2+的主次順序是B>A>D>C,即AEPS初始濃度>pH>吸附時間>吸附溫度。由表4可知,AEPS初始濃度、pH和吸附時間對Cu2+吸附有極顯著(P<0.01)影響,最佳吸附條件為A3B2C2D2,取最佳條件進行驗證實驗,AEPS吸附率為88.27%,即pH4.5,AEPS濃度1.5 g/L,吸附溫度40 ℃,吸附時間45 min,最佳吸附率為88.27%。

表3 AEPS吸附Cu2+正交試驗優化

表4 AEPS吸附Cu2+正交試驗方差分析表

如表5所示,通過極差分析可知A、B、C、D四個因素影響AEPS吸附Cd2+的主次順序是B>A>D>C,即AEPS初始濃度>pH>吸附時間>吸附溫度。由表6可知,AEPS初始濃度和pH對Cd2+吸附有極顯著(P<0.01)影響,吸附時間對Cd2+吸附有顯著(P<0.05)影響,最佳吸附條件為A3B2C3D2,取最佳條件進行驗證實驗,AEPS吸附率為77.81%,即pH6.5,AEPS濃度1.5 g/L,吸附溫度45 ℃,吸附時間60 min,此時對應的吸附率為77.81%。由AEPS對Cu2+和Cd2+的吸附最優條件中可以看出,對兩種重金屬離子吸附影響因素最主要的是吸附pH不同,在Cu2+的最優條件下Cd2+也有吸附效果,但在Cd2+的最優條件下pH為6.5,在此pH下Cu2+會產生沉淀。因此若對溶液中同時存在Cu2+和Cd2+時,可以采用先在Cu2+的最優條件下吸附Cu2+,使Cu2+的吸附率達到最高,然后調整溶液pH,溫度等條件以達到Cd2+的最優條件,在此條件下吸附Cd2+。

表5 AEPS吸附Cd2+正交試驗優化

表6 AEPS吸附Cd2+正交試驗方差分析表

2.4 外貌觀察

如圖6所示,經過真空凍干后,AEPS吸附重金屬離子前后外貌存在明顯差異,A為AEPS,凍干后為淡黃色絮狀物質,結構緊密;B為AEPS-Cu,凍干后結構松散,呈顆粒和碎片狀,顏色略微偏藍；C為AEPS-Cd，凍干后狀態和AEPS-Cu相似,顏色較AEPS偏淺。

圖6 AEPS、AEPS-Cu和AEPS-Cd外貌觀察

2.5 掃描電子顯微鏡分析

如圖7所示,圖7A～圖7F顯示了AEPS、AEPS-Cu和AEPS-Cd在掃描電子顯微鏡下的表面形態,吸附前(圖7A、圖7B),AEPS結構以薄片為主,伴有一些碎片狀和桿狀形態,并且表面平整無其他物質存在。吸附Cu2+和Cd2+后(圖7C～圖7F),AEPS表面不平整,以碎片狀和桿狀為主,這和吸附后(圖6)外貌觀察結果一致,在5000倍放大倍數下觀察,發現AEPS表面變粗糙,明顯看到有其他物質存在,這可能是因為Cu2+和Cd2+吸附于AEPS表面,導致表面結構發生了變化。

圖7 AEPS、AEPS-Cu和AEPS-Cd的SEM觀察

2.6 X-射線能譜分析

對AEPS、AEPS-Cu和AEPS-Cd進行EDS觀察,結果如圖8～圖10所示,由圖8可知,AEPS吸附金屬離子前,AEPS中主要元素為C、N、O,還有少數Na、Mg、P、S、Cl存在,這可能是由于在羅耳阿太菌發酵過程中,發酵培養基中含有檸檬酸、MgSO4·7H2O、KCl,AEPS在發酵和提取過程中吸附了這些離子。由圖9、圖10可知,AEPS吸附Cu2+后,譜圖中出現了之前沒有的Cu和Cd元素,說明AEPS成功吸附了Cu2+和Cd2+,根據能譜峰強度來看,AEPS、AEPS-Cu和AEPS-Cd各個元素含量都不一樣,這可能是由于EDS結果取決于AEPS的孔隙率和表面均勻性[31],并且由峰的面積可知,AEPS吸附Cu2+的能力大于Cd2+的能力,除了pH、多糖濃度等影響因素外,還可能是因為Cd2+的原子半徑比Cu2+的大,Cu2+更有利于AEPS的吸附[32],該結果與AEPS-Cu和AEPS-Cd的單因素和正交試驗結果相吻合。

圖8 AEPS X射線能譜儀分析

圖9 AEPS-Cu X射線能譜儀分析

圖10 AEPS-Cd X射線能譜儀分析

2.7 紅外光譜分析

AEPS吸附Cu2+和Cd2+前后的紅外光譜如圖11所示,多糖具有典型的特征吸收峰,對于AEPS,3392.63 cm-1處的吸收峰是O-H的伸縮振動產生的,這是多糖的主要官能團,2929.74 cm-1處的吸收峰是C-H的伸縮振動吸收峰,AEPS吸附Cu2+和Cd2+后,O-H的吸收峰分別移動至3398.42和3388.71 cm-1,C-H的吸收峰移動至2933.67 cm-1,這可能是由于吸附作用,Cu2+和Cd2+取代了官能團中的H所導致;1240.17 cm-1處的吸收峰是C-H變角振動引起的吸收峰,由圖譜可以看出AEPS-Cu和AEPS-Cd在此處的峰明顯增強;1080.09 cm-1處的吸收峰是由兩種C-O伸縮振動引起的吸收峰,AEPS-Cu移動至1112.88 cm-1,且峰型明顯變寬,AEPS-Cd移動至1078.16 cm-1,峰型與AEPS-Cu相比較窄,說明AEPS吸附Cu2+能力強于Cd2+;900～800 cm-1處的吸收峰是β型C-H變角振動的特征吸收峰,這與AEPS是β型葡聚糖結論一致[33],且吸附金屬離子后,該吸收峰都明顯增強;600～400 cm-1處的吸收峰主要是CCO變形振動吸收峰,由圖11可以看出,AEPS在468.68 cm-1有吸收峰,而在AEPS-Cu和AEPS-Cd譜圖中消失了,這可能是由于金屬離子的加入將其雙鍵結構打破導致的。通過FTIR分析可以發現,AEPS中的羥基、羧基等官能團參與了反應。Liu[34]報道多糖吸重金屬離子的主要機理是通過羥基、羧基和酰胺基團的絡合反應,Wei等[35]研究發現,羧酸中的羰基、酚類碳氫鍵和酰胺基團的拉伸和振動在重金屬吸附中起著重要作用,而Dang等[36]則發現羧基基團的去質子化形式的靜電吸附和非離子化羥基與重金屬離子的絡合作用也是一種重要的吸附機理。推測AEPS吸附Cu2+和Cd2+的主要機理是Cu2+和Cd2+取代了O-H和C-H官能團中的H+,并與C-O官能團發生了絡合反應,同時打破了CCO官能團中的雙鍵,這些反應的發生使得AEPS能夠很好地吸附Cu2+和Cd2+。

圖11 AEPS、AEPS-Cu和AEPS-Cd紅外光譜分析

3 結論

AEPS吸附Cu2+最優工藝為pH4.5,AEPS濃度1.5 g/L,吸附溫度40 ℃,吸附時間45 min,吸附率為88.27%;AEPS吸附Cd2+最優工藝為pH6.5,多糖濃度1.5 g/L,吸附溫度45 ℃,吸附時間60 min,吸附率為77.81%。掃描電子顯微鏡和X射線能譜儀結果表明,AEPS為薄片和桿狀結構,吸附Cu2+和Cd2+后表面變粗糙,以桿狀和碎片為主,并在能譜圖中出現Cu和Cd元素峰。紅外光譜結果表明,AEPS中的O-H、C-H、C-O和CCO官能團和Cu2+、Cd2+之間產生靜電吸附和絡合作用,是吸附反應的關鍵基團。本文研究的結果,為AEPS處理重金屬污染的食品工業和農業用水提供了可參考的理論依據。