蒜黃根膳食纖維提取工藝優化及其理化性質分析

馬 斌,羅延麗,王永康，劉鑫燕,劉云國,康大成

(臨沂大學生命科學學院,山東臨沂 276000)

蒜黃為蔥科為多年生草本植物,別名黃韭菜、韭黃,是利用大蒜鱗莖在避光條件下進行栽培而成。我國各地均有種植,營養豐富,是人們普遍種植和喜食的蔬菜。然而蒜黃種植會產生大量的蒜黃根,據田間測定,每產出蒜黃1200公斤,可同時產出蒜黃根1000公斤左右。目前蒜黃根主要作為生產垃圾處理,大量的蒜黃根不僅會產生環境污染問題,也會造成大量的資源浪費。因此探索蒜黃根的有效加工利用,對于延長蒜黃產業鏈,提高產業經濟效益具有重要意義。

膳食纖維是一類不被人體消化分解的結構復雜的多糖類天然大分子物質的總稱。按溶解性不同可分為水溶性膳食纖維(soluble dietary fiber,SDF)和非水溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber,IDF)兩類[1-2]。研究表明,膳食纖維具有促進胃腸蠕動、增加糞便體積、預防便秘和心血管疾病等保健功能,現已作為食品工業的重要基料而被開發和應用[3-4]。據測定,蒜黃根中總膳食纖維(total dietary fiber,TDF)為39.9 g/100 g(干基),IDF含量為34.9 g/100 g(干基),均高于鮮蒜瓣中的TDF和IDF含量(TDF為33.2 g/100 g(干基),IDF為20.4 g/100 g(干基))。因此提取蒜黃根中膳食纖維,一方面可促進資源再利用,另一方面可為功能性食品和健康食品開發提供優質原料。目前國內外已開展對大蒜秸稈的綜合利用。黃六容等[5]采用超聲、酶解及超聲復合酶解法對大蒜秸稈SDF進行改性處理,結果發現,超聲—復合酶解法提取的大蒜秸稈TDF結構疏松,比表面積較大,對葡萄糖和膽固醇具有較強的吸附性。趙勻淑等[6]則進一步發現,采用超聲—復合酶解法提取得到的SDF,不僅得率最高并且具有良好的自由基清除能力。然而目前國內外尚未開展蒜黃根膳食纖維的提取和綜合利用。

因此,本研究以蒜黃根為研究對象,在單因素實驗基礎上采用響應面曲線法中的Box-Behnken試驗對復合酶法提取蒜黃根TDF的工藝進行優化研究,并對最優條件下得到的蒜黃根TDF的功能性質和抗氧化性進行了初步分析,以期為蒜黃根的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒜黃根(AlliumsativumL.,由蒼山紫皮大蒜鱗莖避光種植而成) 由山東省臨沂市平邑縣溫水鎮政府提供;α-淀粉酶(3700 U/g)、纖維素酶(3 U/mg)、中性蛋白酶(50000 U/g) 北京索萊寶科技有限公司;膽固醇(98%)、福林酚溶液 北京索萊寶生物科技有限公司;葡萄糖、鄰苯二甲醛、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、無水乙醇、碳酸鈉、氫氧化鈉等 均為國產分析純。

BS-210S型電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司;萬特千分之一分析天平 杭州萬特衡器有限公司;超純水機(芷昂-BEST) 上海芷昂儀器有限公司;DZF-6094型真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;752紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;Mikro-220R BS-210S型離心機 德國Hettich科學儀器公司;SHZ-S(Ⅲ)循環水式多用真空泵 上海力辰邦西儀器科技有限公司;HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海資一儀器設備有限公司;雷磁pH計 上海雷磁儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒜黃根TDF提取工藝 新收割的蒜黃根經洗滌、去除蒜瓣后,將剩余的大蒜須根在60 ℃條件下烘干至恒重。粉碎后過60目篩得到蒜黃根粉。準確稱取3 g的蒜黃根粉,為保證酶解過程中pH穩定,按料水質量體積比1∶20加入磷酸鹽緩沖液(pH6.0,0.001 mol/L NaH2PO4),加入0.4%(w/w,以蒜黃根干粉為基準)的復合酶(經預實驗測定,淀粉酶和纖維素酶質量的最優組成比為1∶1)后,調節至指定的pH和溫度酶解一定時間,煮沸10 min滅酶,調整pH至6.0,于60 ℃水浴中加入0.2%(w/w,以蒜黃根干粉為基準)的中性蛋白酶酶解30 min后煮沸滅酶10 min,以無水乙醇沉淀1 h,抽濾后將所得濾渣于105 ℃烘箱中干燥即得產品TDF。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 酶解pH 將蒜黃根粉在溫度65 ℃下酶解1.5 h,采用不同酶解pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)進行提取,以蒜黃根TDF得率為指標確定酶解pH。

1.2.2.2 酶解時間 將蒜黃根粉在酶解pH6.0、酶解溫度65 ℃條件下,采用不同酶解時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)進行提取,以蒜黃根TDF得率為指標確定酶解時間。

1.2.2.3 酶解溫度 將蒜黃根粉在pH6.0,酶解1.5 h條件下,采用不同酶解溫度(45、50、55、60、65 ℃)進行提取,以蒜黃根TDF得率為指標確定酶解溫度。

1.2.3 響應面法優化提取工藝條件 以單因素實驗結果為基礎,根據Box-Behnken試驗設計原理,以酶解pH、酶解溫度和酶解時間為變量,分別以A、B和C表示,以蒜黃根TDF得率為響應值,采用三因素三水平響應面分析法求取優化的工藝參數,實驗因素與水平見表1。

表1 響應面分析因素水平表

1.2.4 蒜黃根TDF得率的測定 參考Xue等[7]方法并做適當修改,稱取蒜黃根粉3.0 g(M1),采用1.2.1方法提取后,將抽濾得到的濾渣于105 ℃烘箱中干燥至恒重后,稱取產品TDF的質量(M2)。按下式計算蒜黃根TDF得率:

式(1)

1.2.5 持水、持油能力和膨脹性測定

1.2.5.1 持水性 參考Xue等[7]方法并做適當修改,稱取蒜黃根粉或經優化條件提取的蒜黃根TDF 1.0 g(M1)于100 mL燒杯中,加入去離子水70 mL,磁力攪拌12 h后轉移至離心管中,以5000 r/min離心10 min,除去上清,稱取沉淀質量(M2)。按下式計算樣品的持水性:

式(2)

1.2.5.2 持油性 參考Jia等[8]方法并做適當修改,稱取蒜黃根粉或經優化條件提取的蒜黃根TDF 1.0 g(M1)于50 mL離心管中,加入大豆油10 mL,攪拌均勻后靜置16 h,5000 r/min離心10 min,去除上油層,稱取沉淀質量(M2)。按下式計算樣品的持油性:

式(3)

1.2.5.3 膨脹性 參考申輝等[9]方法,準確稱取蒜黃根粉或經優化條件提取的蒜黃根TDF 2.00 g(M),置于50 mL量筒中,靜置使粉末表面平整后讀數,記錄體積數(V1),加入30 mL蒸餾水,攪拌均勻后在25 ℃條件下放置24 h,讀取浸泡后膨脹的體積數(V2),按下式計算樣品的膨脹性:

式(4)

1.2.6 吸附能力測定

1.2.6.1 吸附葡萄糖能力 參考Peerajit等[10]方法,稱取蒜黃根粉或經優化條件提取的蒜黃根TDF 0.1 g(M)于250 mL的錐形瓶中,加入50 mL(V)質量濃度為100 μg/mL(C0)的葡萄糖溶液,37 ℃振蕩6 h后,5000 r/min離心20 min,吸取上清液,采用蒽酮法測定上清液中葡萄糖含量(C1)。樣品對葡萄糖吸附能力按下式計算:

式(5)

1.2.6.2 吸附膽固醇能力 參考Chu等[11]方法,市售雞蛋取蛋清留蛋黃,加入9倍體積去離子水充分攪打成均勻乳液,分別稱取1.0 g(M)蒜黃根粉和經優化條件提取的蒜黃根TDF于100 mL的錐形瓶中,加入50 g攪拌均勻的蛋黃液,在37 ℃下振蕩2 h,10000 r/min轉速下離心10 min后吸取上清液,采用鄰苯二甲醛法測定膽固醇含量。蒜黃根粉和TDF對膽固醇的吸附量按下式計算:

式(6)

其中,W0為吸附前蛋黃液中膽固醇質量(mg);W1為吸附后蛋黃液中膽固醇質量(mg);M為蒜黃根粉或蒜黃根TDF(g)。

1.2.7 抗氧化能力測定 準確稱取0.10 g蒜黃根粉或蒜黃根TDF于50 mL去離子水中充分振蕩均勻,用于下述抗氧化性指標測定。

1.2.7.1 總酚含量 參考Ledoux等[12]方法,取2.5 mL樣品,加入10%(v/v)福林酚溶液2.5 mL,常溫靜置反應3 min,再加入75 mg/mL Na2CO3溶液2 mL后混勻,于25 ℃反應1 h,以去離子水為空白,在765 nm下測定吸光度。以沒食子酸為標準品繪制標準曲線,標準曲線為Y=0.0013X-0.0265,R2=0.9996。結果以mg/100 g干粉表示。

1.2.7.2 羥基自由基清除能力 參考Shi等[13]方法并做適當修改,取2 mL樣品,加入1.4 mL 6 mmol/L H2O2溶液,2 mL 1.5 mmol/L FeSO4溶液,混合均勻,靜置10 min之后,加入0.6 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液,再次混勻,37 ℃條件下水浴1 h,在波長510 nm條件下測定吸光度值A1。羥基自由基清除率為:

式(7)

其中A0為空白對照吸光度;A1為樣品吸光度;A2為樣品本底管吸光度,下同。

1.2.7.3 DPPH自由基清除能力 參考Blois等[14]方法略作修改,取3 mL樣品,加入無水乙醇配制0.1 mmol/L DPPH溶液3 mL,25 ℃恒溫水浴30 min,混勻后于517 nm測其吸光度A1。

式(8)

1.3 數據處理

上述所有試驗每個處理組均重復4次,取其平均值。結果采用Microsoft Office Excel 2003和Design-Expert V10進行數據分析處理和作圖。對于單因素實驗,應用SAS 9.2軟件對數據進行方差分析;對于蒜黃根TDF理化性質分析,采用SAS 9.2軟件對數據進行t-test分析,差異顯著性水平均為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 蒜黃根TDF提取單因素實驗

2.1.1 酶解pH對蒜黃根TDF得率的影響 酶解pH對蒜黃根TDF得率的影響見圖1。由圖1可知,蒜黃根粉在65 ℃下酶解1.5 h時其TDF得率隨pH的升高呈先上升后下降的趨勢。pH7.0時TDF得率最高為70.83%(P<0.05),當pH進一步升高時,蒜黃根TDF得率顯著降低(P<0.05)。這可能與pH在7.0附近時,復合酶的活性較高有關[15]。因此選擇酶解pH7.0進行下一步工藝條件優化。

圖1 酶解pH對蒜黃根TDF得率的影響

2.1.2 酶解時間對蒜黃根TDF得率的影響 酶解時間對蒜黃根TDF的影響見圖2。由圖2可知,提取時間在0.5～2.0 h之間時,蒜黃根粉TDF得率隨時間的延長而升高。當提取時間為2.5 h時,蒜黃根TDF得率與2.0 h無顯著差異(P>0.05)。其原因在于,酶解時間較短時,部分淀粉未完全水解,增加酶解時間有助于TDF的提取;當酶解時間超過2.0 h后,TDF得率呈下降趨勢。分析原因在于,一方面SDF被降解為低分子量多糖、低聚糖或單糖,而無法被乙醇沉淀;另一方面,部分半纖維素被水解為非膳食纖維,從而使TDF得率降低[16-17]。因此酶解時間選擇2.0 h較合適。

圖2 酶解時間對蒜黃根TDF得率的影響

2.1.3 酶解溫度對蒜黃根TDF得率的影響 由圖3可知,酶解溫度在45～60 ℃時,蒜黃根TDF得率隨溫度升高而升高,在60 ℃時達到最大值,但與55 ℃時差異不顯著(P>0.05);當溫度在65 ℃時,蒜黃根TDF得率顯著下降(P<0.05)。其原因在于復合酶在最適溫度60 ℃時酶活性最大,偏離最適溫度,兩種酶的酶活性將受到抑制[18-19]。因此,酶解溫度選擇60 ℃較為適宜。

圖3 酶解溫度對TDF得率的影響

2.2 蒜黃根TDF提取條件響應面優化

2.2.1 模型建立與顯著性分析 以酶解pH(A)、酶解溫度(B)和酶解時間(C)三個因素,以蒜黃根TDF得率(Y)為響應值進行Box-Behnken設計,實驗設計方案見表2。其中實驗1～12是析因實驗,實驗13～17是中心零點實驗。零點實驗重復5次,用以估計實驗誤差。

表2 響應面分析試驗設計及結果

利用Design-Expert V10軟件中的Box-Behnken模型,對表2中數據進行多元回歸擬合和方差分析,分析結果見表3。

由表3可知,模型F值為130.84(P<0.0001),表明所得回歸模型極顯著,而回歸方程失擬檢驗P>0.05,差異不顯著,模型的相關系數R2=0.9865,因此所得回歸模型可靠,擬合度較好,可較好地描述蒜黃根TDF提取過程中各因素與響應值之間的真實關系,可用于預測蒜黃根TDF的最佳提取工藝條件。對該回歸方程系數進行顯著性檢驗可知,一次項(B、C)、交互項AB與二次項(A2、B2、C2)對蒜黃根TDF得率影響極顯著(P<0.01),一次項A和交互項BC影響顯著(P<0.05),而交互項AC影響不顯著(P>0.05)。去除不顯著交互項后,得到蒜黃根TDF得率對各因素的回歸方程:

Y=-316.14+47.57A+6.62B+15.10C-0.15AB+0.11BC-2.73A2-0.05B2-4.90C2

2.2.2 響應面分析及優化 為分析試驗因素交互作用對蒜黃根TDF得率的影響,采用Design-Expert V10軟件分析,得到的響應面見圖4。

由圖4(A)可知,在所考察的范圍內,當酶解溫度不變時,隨酶解時間的延長,蒜黃根TDF得率呈現先升高后降低的趨勢;酶解時間不變時,隨酶解溫度的升高,也表現為相同的變化趨勢。表明酶解時間與酶解溫度間存在明顯的交互作用。同理,圖4(B)中酶解pH和酶解溫度的交互作用與圖4(A)變化趨勢一致。這與回歸方程中AB、BC項顯著性一致。

表3 響應面模型方差分析結果

圖4 酶解溫度與酶解時間(A)、酶解溫度與酶解pH(B)交互作用對蒜黃根TDF得率的響應面圖

在所選實驗因素范圍內,利用Design Expert V10軟件,得到酶法提取蒜黃根TDF的最優條件為:酶解pH7.02、酶解溫度61.87 ℃、酶解時間2.26 h。考慮到實際操作的可行性,將蒜黃根TDF提取條件調整為pH7.0、酶解溫度62 ℃、酶解時間2.3 h。在該條件下的驗證實驗結果表明,蒜黃根TDF得率為72.47%±0.08%,與模型預測值72.59%基本一致,表明所建立的數學模型對優化蒜黃根TDF的提取工藝是可行的。

2.3 蒜黃根TDF理化性質分析

2.3.1 持水性、持油性和膨脹性 當膳食纖維進入人體胃腸道內時,其功能性主要體現在可通過吸收食物中的水分、脂肪從而體積膨脹使人產生飽腹感,還可刺激腸道的蠕動,促進糞便排出從而減輕毒素對人體的危害[20-22]。在最優條件下提取的蒜黃根TDF的持水性、持油性及膨脹性測定結果如表4所示。由表4可知,經提取后的蒜黃根TDF持水性、持油性及膨脹性均優于未提取前的蒜黃根粉(P<0.05)。已有研究表明,TDF持水能力與纖維中SDF含量呈正相關,與IDF含量呈負相關[23]。由于蒜黃根粉經酶解和熱處理后,部分IDF轉化為SDF。與IDF相比,SDF含有更多的親水基團、表面積和水結合位點,從而具有更高的持水能力和溶脹能力[24]。另一方面,與香椿葉、竹筍、大蒜秸稈TDF等相比,本研究提取得到的蒜黃根TDF的持水、持油能力和體積膨脹能力與之持平或更優[5,15,24],表明提取得到的蒜黃根膳食纖維不僅有助于改善人體腸道功能,也可作為新型健康食品的優質原料。

表4 蒜黃根TDF與蒜黃根粉持水性、持油性及膨脹性比較

2.3.2 吸附能力 膳食纖維可吸附葡萄糖和膽固醇,降低小腸內葡萄糖和膽固醇的有效濃度,從而降低餐后人體血糖水平的升高和減少膽固醇的吸收[25-26]。經測定發現,提取后的蒜黃根TDF對葡萄糖吸附能力達到了8.00 mg/g,對膽固醇吸附能力為10.52 mg/g,均顯著高于提取前的蒜黃根粉(P<0.05)。淀粉酶和纖維素酶在最優工藝條件下作用于蒜黃根時,可改變TDF中木質素的表面結構和疏水性,使其結構更加松散、多孔[27-28],從而更容易與葡萄糖和膽固醇發生吸附作用,這與其對持水性、持油力和膨脹性的影響結果一致,但具體的機理原因還需進一步驗證。

表5 蒜黃根TDF與蒜黃根粉吸附能力比較

2.3.3 抗氧化能力 羥基自由基是一種活性氧自由基,可造成食品中脂質、蛋白質過氧化和分解,人體內羥基自由基過多可引起急性損傷、慢性疾病和衰老等現象[29-30]。由表6可知,與蒜黃根相比,經提取后的蒜黃根TDF的羥基自由基清除能力顯著下降(P<0.05)。同時,由DPPH自由基清除測定結果可知,提取后的蒜黃根TDF的DPPH自由基清除率也顯著降低(P<0.05)。分析原因在于,蒜黃根經酶解、高溫滅活、乙醇沉淀等處理后,大蒜中含有的抗氧化物質被大量溶出和破壞,導致其抗氧化能力的降低[31]。大蒜中總酚物質是發揮其抗氧化性的重要活性成分之一[32],故本研究同時測定了蒜黃根TDF與蒜黃根粉中的總酚含量,由表6可知,未提取前蒜黃根粉中總酚含量較高(50.38 mg/100 g干粉),顯著高于提取后的蒜黃根TDF(P<0.05)。這與蒜黃根TDF與蒜黃根粉抗氧化能力測定結果一致。

表6 蒜黃根TDF與蒜黃根粉抗氧化能力比較

3 結論

采用響應面優化酶法提取蒜黃根中TDF,結果表明:蒜黃根TDF得率的最佳提取工藝條件為酶解pH7.0、酶解溫度62 ℃、酶解時間2.3 h。蒜黃根TDF得率為72.47%±0.08%,與模型預測值72.59%基本一致,表明所建立的數學模型可用于優化蒜黃根TDF的提取工藝。對提取后的蒜黃根TDF理化性質分析可知,提取后的TDF持水性、持油性、膨脹性以及對葡萄糖和膽固醇的吸附能力均顯著高于蒜黃根粉。然而蒜黃根TDF的抗氧化能力較蒜黃根粉顯著降低,后續研究中可采用超聲波、超高壓均質或微生物發酵法等技術進行改善。因此總體來看,可將蒜黃根TDF作為肉類和糧油類食品原料加以利用,開發新型健康食品,進一步提高資源利用率與產品附加值。