基于ICP-AES的不同產地干姜無機元素分析與評價

鄒冬倩,嚴 輝,*,李鵬輝,濮宗進,周桂生,郭 盛,楊 健,黃勝良

(1.南京中醫藥大學,江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，國家中醫藥管理局中藥資源循環利用重點研究室,江蘇南京 210023;2.中國中醫科學院中藥資源中心,道地藥材國家重點實驗室培育基地,北京 100700;3.江蘇融昱藥業有限公司,江蘇淮安 223001)

干姜(ZingiberisRhizoma)為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根莖,冬季采挖,除去須根和泥沙,曬干或低溫干燥[1]。干姜始載于《神農本草經》,具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的功效,臨床上常用于脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、肢冷脈微、寒飲喘咳等癥[2-4]。干姜中的有效成分包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、姜烯酚及姜酮等酚類成分[5],以及姜醇、姜烯等揮發性成分[6]?，F代藥理研究表明,干姜具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、保肝等作用[7-9]。

姜作為藥食兩用的中藥,在中國已經有2000多年的食用歷史,《論語》記載,孔子有“不撤姜食,不多食”之句。中國是姜的發源地之一,也是最早種植姜的國家。姜,適宜溫暖濕潤氣候,不耐高溫和強光,適宜土質肥沃、土層深厚、透氣性好的沙壤土、壤土或粘壤土,這些生長特性決定了姜的分布產區[10-11]。除東北、西北等高寒地區以外,姜在全國各地均有分布,主產于四川、云南、貴州、廣西、山東、湖南等地[12]。不同的地理生態環境,其無機元素的組成也同樣存在差異[13-15]。隨著研究的深入,發現土壤中的無機元素能夠影響藥用植物次生代謝產物的積累,進一步影響著藥材的質量[16-17]。目前,關于干姜中的有效成分含量以及指紋圖譜研究較多[18-20],但是針對不同產地的干姜中無機元素的組成研究不夠充分[21-22]。而重金屬元素也已成為公認的對人體有害的元素[23],同時值得關注的是,目前國內干姜主要產區多屬于重金屬土壤背景值較高的區域,具有潛在的重金屬超標風險,因此對干姜藥材中無機元素的組成規律的研究極為重要。

現今,關于中藥中的無機元素的測定方法主要為石墨爐原子吸收法(GFAAS)、原子吸收分光光度法(AAS)、火焰原子吸收光譜法(FAAS)、電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES),而ICP-AES是目前多元素測定最先進、最準確的技術手段[24],已廣泛應用于食品、藥品中的無機元素的檢測[25-26]。ICP-AES能夠檢測光學光譜(165～800 nm),可以同時檢測原子光譜中的多條譜線,并且能夠同時檢測多種原子和離子,ICP-AES的檢測限較低,重現性較好,儀器的分析速度較快[27],因此采用ICP-AES法能夠快速、準確地分析干姜中無機元素的組成。

本研究主要采用ICP-AES法對來自云南、四川、貴州、山東等地的干姜樣品中無機元素含量進行測定,采用聚類分析和主成分分析對不同產地的樣品進行化學計量學分析,以期分析不同產地樣品的差異。對去皮與不去皮的樣品中重金屬元素的含量作比較,為干姜藥材的產地加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Al、As、B、Ba、Be、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn(GSB 04-1767-2004),Na、P、K(GSB 04-1764-2004),In、Ge、Bi、Rh、Sc、Tb、Y(GSB 04-2826-2011),Hg(GSB 04-1728-2004) 國家有色金屬及電子材料分析測試中心;硝酸(優級純) 德國默克公司;去離子水 屈臣氏蒸餾水；28批干姜藥材 經南京中醫藥大學嚴輝副教授鑒定為姜科(Zingiberaceae)植物姜(ZingiberofficinaleRosc.)的干燥根莖,標本存放于南京中醫藥大學標本館。干姜樣品采集于2017年4～6月,置于干燥陰涼密封罐中保存,干姜樣品包含不同規格等級,以及相同規格等級的不同批次樣品,其中S9與S11為不同批次的低硫母姜,S12、S15與S20為不同批次的高硫小黃姜,S17與S18為不同批次的低硫姜片,S23與S24為不同批次的低硫未去皮小黃姜,S27與S28為不同批次的低硫去皮小黃姜,詳細信息見表1。

表1 28批不同產地干姜樣品信息表

OptimaTM2100 DV電感耦合等離子體發射光譜儀 美國Perkin Elmer公司;HH-S6數顯恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司;Sartorius BT 125D十萬分之一電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;SAGA-10TY超純水器 南京易普易達科技發展有限公司;BJ-150高速多功能粉碎機 浙江德清拜杰電器有限公司;D2012高速臺式離心機 大龍興創實驗儀器北京有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液制備 取干姜樣品粉末(過3號篩)0.5 g,精密稱定,置于50 mL塑料離心管中,加濃硝酸7 mL,放置于80 ℃水浴鍋中,消解2 h。待溶液澄清透明或略帶黃色時,消解完畢后,冷卻至室溫,用去離子水定容至50 mL,離心(13000 r/min,10 min),取上清液[28]。

1.2.2 對照品溶液制備 分別取多元素標準溶液,精密量取,用3% HNO3稀釋,配制成適宜濃度的混合標準溶液,見表2。標準溶液中Li、Be、B、Tl、Pb、Na、Mg、Al、P、K、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Sr、Y、Rh、Cd、Sn、Sb、Ba、Tb濃度均為200 μg/L,Bi為400 μg/L,Hg為5 μg/L。隨機選取一個樣品測定其Ge、In等元素的響應信號(CPS),選擇信號較低的并且原子質量與被測元素接近的元素作為內標。最終選擇Ge 74和In 115作為內標。

表2 32種無機元素線性回歸方程、相關系數、線性范圍

1.2.3 儀器參數 等離子體射頻功率1100 W,冷卻氣體流量15 L/min,輔助氣流量0.94 mL/min,載氣流量3.0 mL/min,觀測方向為Axial,觀測高度為15 nm,一次讀數時間為5 s,進樣延時30 s,泵速為15 r/min,樣品提升速度1.0 mL/min,采樣深度8 mm,分析模式采用全定量模式[29-31]。

1.2.4 標準曲線的制備 將標準品溶液逐級稀釋,以3% HNO3為空白溶液,以Ge和In為內標,以元素濃度C(μg/L)作為橫坐標(X),信號強度(CPS)作為縱坐標(Y),制作各元素的標準曲線。得到各無機元素的回歸方程如表2所示,其中Li、Be、B、Tl、Pb、Al、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Sr、Y、Rh、Cd、Sn、Sb、Ba、Tb的回歸方程的相關系數r>0.999。

1.3 數據處理

將28批干姜樣品的32種無機元素含量作為變量,將測定數據導入SIMCA-P 14.0軟件,進行主成分分析(PCA)和聚類分析(CA)。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度試驗 將混合標準溶液,按上述方法連續重復測定6次,各元素含量的RSD在1.52%～4.96%,表明儀器精密度良好。

表3 28批不同產地干姜樣品中32種無機元素含量(mg/kg)

續表

2.1.2 重復性試驗 平行制備6份供試品溶液,按上述方法測定,各元素含量的RSD在2.46%～3.59%,表明儀器重復性良好。

2.1.3 穩定性試驗 取供試品溶液,按上述方法測定,分別于0、1、2、4、6、8、12 h測定,各元素含量的RSD<4.59%,表明溶液在12 h內穩定。

2.1.4 加樣回收率試驗 精密稱取樣品S1樣品,分別加入等量S1樣品中各元素含量的對照品,平行3份,按上述方法測定,加樣回收率為96.69%～112.22%,RSD<4.10%,說明該方法準確可靠。

2.2 樣品測定結果

取28批樣品,照1.2.1項下方法制備供試品溶液,按照1.2.3項下儀器參數上機測定,結果見表3。28批干姜樣品中共檢測到32種元素,其中Rh、Tb、Sb未檢出,僅貴州盤縣的樣品檢測出Tl、Sn,其他樣品均未檢測到這兩種元素。干姜中含量較高的元素為K、P、Mg、Na、Mn含量范圍分別為22587.83～92248.51、1778.29～4449.33、1848.98～4293.83、39.72～1216.93、79.16～3864.6 mg/kg。除Mn以外,還含有微量元素Fe(27.84～960.26 mg/kg)、Zn(14.3～55.45 mg/kg)。重金屬元素Pb(0.21～1.93 mg/kg)、Cd(0.02～0.50 mg/kg)、As(<1.01 mg/kg)、Hg(<6.19 mg/kg)、Cu(2.40～7.96 mg/kg)。

2.3 不同產地干姜無機元素分析

2.3.1 聚類分析 在聚類分析譜系圖中,縱坐標為距離,橫坐標為樣品編號,在距離為200時,所有的干姜樣品被劃分為兩類,一類是來自山東省的樣品,另一類是來自四川省、云南省、貴州省的樣品。山東地區的樣品與其他地區的樣品無機元素組成差異大,而西南地區貴州、云南、四川的干姜無機元素組成相似,可能是由于地理環境的因素影響了干姜中無機元素的積累。

圖1 28批干姜聚類分析譜系圖

2.3.2 主成分分析 兩個主成分的貢獻率分別為PC1=0.903,PC2=0.023,分析發現來自四川、云南、貴州的樣品較好地聚集為一類,來自山東的樣品聚為一類。因此,四川、云南、貴州地區所產的干姜在無機元素的組成上較為相似,而山東地區所產的干姜與它們的差異較大。其中K、Na、P、Mg、Mn是對分類影響較大的幾種變量。上述幾種元素為干姜中含量較高的幾種元素,其含量的變化對分類結果有較大的影響,主成分分析結果與聚類分析結果具有一致性。

圖2 28批干姜樣品主成分得分圖(A)與Loading-plot圖(B)

2.4 云南干姜無機元素分析

2.4.1 云南干姜無機元素組成分析 根據干姜藥材的本草考證研究結果,目前干姜的道地藥材產區集中在云南的羅平、師宗。四川的犍為、沐川,貴州的六盤水等地,其中以云南地區為干姜藥材(小黃姜)的主產區。因此,以云南省樣品的各無機元素含量的平均值作為變量,分析云南省干姜的無機元素組成,所測的32種無機元素,K、P和Mg分別占84.22%、7.01%和6.98%,而Mn、Na、Fe和Al分別占0.70%、0.53%、0.20%和0.20%。

圖3 云南干姜無機元素占比分析

2.4.2 云南未去皮干姜與去皮干姜無機元素含量對比 通過對未去皮干姜樣品(S23、S24、S25)以及去皮的干姜樣品(S26、S27、S28)中的重金屬元素含量對比發現,其中Hg、Pb、As、Cd的含量在去皮樣品中顯著低于未去皮的樣品,Cu含量在干姜去皮之后也呈現下降趨勢。因此,干姜經過去皮處理之后,重金屬及有害元素的含量下降,可能與姜皮對重金屬元素的富集作用有關。目前,在四川犍為、云南等干姜主要產區同樣發現去皮之后的干姜中重金屬元素含量顯著降低。而去皮之后干姜中的指標性化學成分含量與去皮之前并無顯著性差異。去皮后干姜中揮發油、總酚含量均無顯著變化,且去皮后能夠降低干燥時間,降低干燥過程中的能源消耗,更有利于實際生產[32]。

圖4 云南未去皮干姜與去皮干姜重金屬元素含量比較

3 討論與結論

28批干姜樣品中,含量相對較高的元素有K、P、Mg、Mn、Na、Fe和Zn,其中以K、P含量最高。K平均含量高達34674 mg/kg,它是維持酸堿平衡,參與能量代謝以及維持神經肌肉的正常功能的重要元素;P平均含量高達2721 mg/kg,它是組成生命的重要物質,參與代謝過程和酸堿平衡的調節;干姜中同樣含有較多人體所需的微量元素,如Fe、Zn、Mn等,因此干姜的營養價值也較高,具備進一步開發功能性食品的潛力。

《中國藥典》2015版中對重金屬含量一般要求為[1]:Pb≤5.0 mg/kg、Cd≤0.3 mg/kg、Hg≤0.2 mg/kg、Cu≤20.0 mg/kg、As≤2.0 mg/kg,但對干姜的重金屬含量并無具體限定要求?！端幱弥参锛爸苿┻M出口綠色行業標準》[15]規定重金屬總量應≤20.0 mg/kg,Cu≤ 20.0 mg/kg,Hg≤0. 2 mg/kg,Pb≤5.0 mg/kg,Cd≤0.3 mg/kg,As≤2.0 mg/kg。結合測定結果,Pb(0.21～1.93 mg/kg)、Cd(0.02～0.5 mg/kg)、As(<1.01 mg/kg)、Hg(<6.19 mg/kg)、Cu(2.4～7.96 mg/kg)。根據上述兩種標準,所有樣品中Pb、As、Cu均符合上述標準,樣品S1～S4、S6～S8、S10、S12、S14～S16、S20～S25、S28中Hg含量超出標準,樣品S1、S6、S9、S20～S25中Cd含量超出標準。干姜藥材在經過去皮處理之后,重金屬元素含量顯著降低,各元素含量低于限定標準,能夠增加藥材的合格率。張利敏等[21]采用火焰原子吸收光譜法測定干姜中Cd含量為0.53 mg/kg,蔣云福等[33]采用火焰原子吸收分光光度法測定Cd含量為4.95 mg/kg,說明干姜中Cd元素含量相對較高,可能與西南地區的土壤具有一定的關聯性。Hg含量較高,但波動較大,可能與Hg的記憶效應相關,在無任何消除汞記憶效應的措施下,0.5 μg/L的Hg即可產生明顯的記憶效應,且隨著Hg濃度的增加,記憶效應不斷增強[34],在實驗過程中并未采取消除Hg記憶效應的相關措施,可能導致樣品測定結果波動較大。

本試驗利用ICP-AES建立了干姜中32種無機元素的測定方法,分析了干姜中無機元素的組成。相關結果可為基于土壤無機元素特征的干姜藥材質量溯源及品質評價研究提供參考。同時,干姜藥材在產地加工時,進行去皮處理,既有利于降低重金屬及有害元素的含量,也有利于縮短干燥時間,節約成本,同時也能為干姜的產地加工方式優化及食品開發應用提供一定的理論依據。