響應面法優化高效液相色譜分析蜂蜜中5種生物胺的衍生條件

梁夢潔,黃麗佳,劉 欣,李 晶,宋春滿,張建鐸,*

(1.云南中煙工業有限責任公司技術中心,云南昆明 650106;2.昆明醫科大學,云南昆明 650500)

生物胺是一類主要由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的弱堿性低分子量含氮化合物,常存在于動植物和微生物體內,食品在發酵或腐爛過程中也會產生生物胺[1]。發酵乳制品、酒類、水產品、肉類產品、調味液等富含蛋白質和氨基酸的食品廣泛存在生物胺[2]。微量的生物胺是生命體內生成荷爾蒙、核酸、蛋白質等的前體物質,在生物細胞中具有重要的生理功能,但攝入過量含有生物胺的食品,會引起中毒,甚至危及性命[3-4]。

蜂蜜是人們喜愛的一種保健食品,含有少量蛋白質和多種游離氨基酸[5],并含多種適宜微生物生長繁殖的營養物質,在酸性環境下易生成生物胺。蜂蜜在加工和儲存過程中均有可能被微生物侵染而產生生物胺。目前有關蜂蜜中生物胺種類和檢測方法鮮有報道,僅見趙玲玲等[6]利用超高效液相色譜-串聯質譜檢測了蜂蜜中8種生物胺含量,而高效液相色譜分析蜂蜜中生物胺含量未見報道。因此有必要建立簡便的高效液相色譜分析蜂蜜中生物胺的方法。

目前,分析生物胺的常用方法主要有離子色譜法[7]、毛細管電泳法[8]、高效液相色譜法[9]、高效液相色譜-串聯質譜法[10]、超臨界流體色譜-串聯質譜法[11]等。其中高效液相色譜法因對儀器配置要求不高而廣為應用,但液相色譜法需要將樣品衍生化處理后才能檢測。衍生化處理分為柱前衍生和柱后衍生兩種。柱后衍生法需要專用的衍生設備,因此柱前衍生-高效液相色譜法分析生物胺應用更廣。柱前衍生法主要有FITC衍生法、OPA衍生法,苯甲酰氯衍生法和丹磺酰氯衍生[12-13],其中丹磺酰氯衍生因簡便穩定被廣為應用[14-15]。影響丹磺酰氯衍生反應的主要因素有衍生體系pH、衍生時間和衍生溫度。不同文獻的衍生條件各不相同,也有文獻對衍生條件進行了單因素優化[16]或正交設計優化[17],但這些實驗設計未能考慮因子的交互作用。為了確定丹磺酰氯衍生法測定蜂蜜中生物胺含量的最佳衍生條件,本實驗采用響應面設計方法,對衍生體系pH、衍生溫度和時間進行了優化,便于蜂蜜中生物胺含量的準確測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈 色譜純，美國Fisher公司;丹磺酰氯 美國Sigma-Aldrich公司，純度99.5%;標準品色胺、酪胺、組胺、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺 純度均大于99.0%,美國Sigma-Aldrich公司;HCl、HClO4、NaOH、NaHCO3、氨水 均為分析純,西隴化工有限公司;冠生園蜂蜜(油菜蜂蜜、楊槐蜂蜜和荊條蜂蜜的混合蜜) 上海冠生園蜂制品有限公司。

Agilent 1200高效液相色譜儀(配備G1312B二元泵,G1367D自動進樣器、G1316B柱溫箱和G1315C二極管陣列檢測器) 美國Agilent公司;Agilent 7696樣品處理工作臺(配備自動衍生功能模塊) 美國Agilent公司;Biofuge Stratos離心機 美國Thermo公司;Sartorius PB-10酸度計 德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 混合標準溶液:分別準確稱取腐胺、精胺、尸胺、亞精胺和組胺標準品100 mg于100 mL容量瓶中,用0.1 mol/L鹽酸溶解定容,配成1.0 mg/mL的單一標準儲備液。根據實驗需要,分別移取不同體積的標準儲備液于容量瓶中,用0.4 mol/L HClO4稀釋成不同濃度的系列標準溶液。

1.2.2 樣品提取 稱取0.5 g蜂蜜至5 mL離心管中,精確至0.01 g,加入2 mL 0.4 mol/L HClO4超聲提取45 min,8000 r/min離心10 min,取上清液衍生。

1.2.3 樣品衍生 衍生方法參考文獻[18],略作改動。移取1 mL樣品提取液和1 mL 20 μg/mL混合標準液于離心管中,加入2 mol/L NaOH溶液200 μL、飽和NaHCO3溶液300 μL、4 mg/mL丹磺酰氯溶液1 mL,渦旋混勻后密封,45 ℃避光衍生40 min,加入100 μL濃氨水,渦旋1 min,靜置30 min用乙腈定容至5 mL,渦旋混勻,8000 r/min離心5 min,上清液經0.45 μm有機濾膜過濾后上機分析。

1.2.4 分析條件 液相色譜柱:Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(100 mm×3 mm,2.7 μm);流動相:A為0.1%乙酸銨水溶液,B為乙腈;洗脫程序:0～5 min,50%～5% A;5～7 min,5% A;7～7.5 min,5%～50% A;7.5～9 min,50% A;流速:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:5 μL。檢測波長:345 nm。

1.2.5 單因素實驗 不同研究者采用丹磺酰氯衍生生物胺時,使用的衍生條件差異較大,衍生體系pH在9.5～12[19-20],衍生溫度在30～70 ℃[21-23],衍生時間在15～60 min[24-26]。本實驗參考多數文獻,設計衍生體系pH、衍生溫度和衍生時間的不同水平進行單因素實驗,考察各因素對生物胺衍生物峰面積響應的影響。

1.2.5.1 衍生體系pH對峰面積響應的影響 設計衍生體系pH9.5、10、10.5、11、11.5和12六個水平進行單因素實驗,固定衍生溫度45 ℃、衍生時間40 min,考察不同衍生體系pH對生物胺峰面積響應的影響,預選出合適pH進行優化實驗。

1.2.5.2 衍生溫度對峰面積響應的影響 設計衍生溫度30、35、40、45、50、55 ℃六個水平進行單因素實驗,固定pH11、衍生時間40 min,考察不同衍生溫度對生物胺峰面積響應的影響,預選出合適的衍生溫度進行優化實驗。

1.2.5.3 衍生時間對峰面積響應的影響 設計衍生時間30、35、40、45、50、55 min六個水平進行單因素實驗,固定pH11、衍生溫度45 ℃,預選出合適的衍生溫度進行優化實驗。

1.2.6 響應面試驗 以衍生體系pH(A)、衍生溫度(B)、衍生時間(C)為響應因子,以各種生物胺峰面積(Y)為響應值,進行Box-Behnken響應面優化設計。以獲取生物胺衍生反應的最優條件。根據單因素實驗結果,pH范圍設為10～12,衍生溫度設為30～60 ℃,衍生時間設為30～50 min。實驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面設計的因素與水平

1.3 數據處理

采用Design-Expert(Ver.11)軟件處理數據,每個處理平行重復3次,取平均值計算分析,繪制響應面圖,計算擬合方程和各因素的最優值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 pH對衍生效果的影響 pH在9.5～12范圍內,5種生物胺的峰面積響應均呈先升后降的趨勢,但5種生物胺稍有差別。腐胺、尸胺和組胺在pH11時峰面積響應最大,然后隨pH升高逐漸降低;精胺和亞精胺在pH10.5時峰面積響應最大,然后隨pH升高而逐漸降低(圖1)。

圖1 pH對生物胺衍生物峰面積響應的影響

2.1.2 衍生溫度對衍生效果的影響 在衍生溫度30～55 ℃范圍內,5種生物胺的峰面積響應均為先隨溫度升高而增加,而后逐漸降低。腐胺和組胺在45 ℃達到峰面積最大值,精胺、亞精胺和尸胺在40 ℃達到最大值,而后逐漸降低。這是因為溫度升度能夠加速衍生化反應,但過高的溫度可能破壞衍生物的穩定性(圖2)。

2.1.3 衍生時間對衍生效果的影響 在衍生時間30～55 min范圍內,5種生物胺的峰面積響應均為先隨衍生時間延長而增加,而后逐漸降低。腐胺和組胺在40 min達到峰面積最大值,精胺、亞精胺和尸胺在45 min達到最大值,而后逐漸降低(圖3)。

2.2 回歸模型建立與參數檢驗

響應面設計的各實驗對應的衍生樣品經高效液相色譜檢測,5種生物胺的峰面見如表2,通過Design-Expert軟件分析實驗數據,可得到各因素水平與生物胺峰面積的擬合方程如下。

腐胺:Y=1590.26-157.02A+ 36.15B+ 40.24C-19.91AB+ 175.73AC-40.11BC-877.94A2-437.08B2-227.08C2

精胺:Y=1134.28-236.08A+31.00B-22.44C-13.86AB+38.76AC-17.50BC-693.33A2-208.47B2-194.66C2

亞精胺:Y=1600.48-282.48A-34.98B-5.08C+25.29AB+147.14AC-54.09BC-706.51A2-576.16B2-446.56C2

尸胺:Y=1344.39-57.58A-17.36B+55.90C+3.73AB+272.78AC+26.09BC-884.35A2-257.20B2-62.98C2

組胺:Y=707.47-169.85A-55.23B+48.23C+32.13AB-19.36AC+112.47BC-345.59A2-159.26B2-141.38C2

5種生物胺擬合模型的方差分析與參數顯著性檢驗結果如表3～表7,5個擬合模型P<0.0001,表明5個模型均有效,具有統計學意義。

腐胺、精胺、亞精胺、尸胺和組胺擬合模型的校正決定系數(AdjustedR2)分別為0.9978、0.9980、0.9970、0.9989和0.9979,預測決定系數(PredictedR2)分別為0.9857、0.9755、0.9876、0.9854和0.9781。各個模型的校正R2>0.99,預測R2>0.99,表明模型擬合度高,試驗誤差小。方差分析結果顯示,模型失擬項P>0.05,說明模型不失擬,能充分反映實際情況,能很好地進行預測。

表2 響應面設計方案與實驗結果

表3 腐胺響應面擬合模型方差分析

腐胺、精胺、亞精胺、尸胺和組胺擬合模型的信噪比(Adeq Precision)分別為65.54、51.03、71.72、68.03和50.65,均大于4,說明該模型響應信號強,可進行真實值的分析和預測試驗結果。變異系數分別為3.42%、4.77%、3.65%、3.29%和4.45%,均小于5%,說明模型是可重復的。

5種生物胺擬合模型的一次項中A(pH)均影響極顯著(P<0.01);腐胺、尸胺、組胺擬合模型的一次項B(衍生溫度)影響極顯著(P<0.01);組胺擬合模型的一次項C(衍生時間)影響極顯著(P<0.01)。除精胺擬合模型外,其余模型一次項C均影響顯著(P<0.05)。5種生物胺擬合模型的二次項均影響極顯著(P<0.01)。腐胺、尸胺、亞精胺擬合模型的交互項AC影響極顯著(P<0.01),精胺和組胺擬合模型的交互項AC影響顯著(P<0.05),各交互項對生物胺擬合模型的影響見圖4,其余交互項均無顯著影響。根據方差分析的F值(P值)可知,3個衍生因素對生物胺響應的影響大小依次為pH>衍生溫度>衍生時間。

表4 精胺響應面擬合模型方差分析

表5 亞精胺響應面擬合模型方差分析

表6 尸胺響應面擬合模型方差分析

表7 組胺響應面擬合模型方差分析

表8 生物胺響應面擬合模型驗證結果

圖4 pH和衍生時間交互作用對生物胺峰面積影響的響應面圖

2.3 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

根據響應面擬合方程進行參數最優分析,得到5種生物胺最優衍生條件如下:腐胺:pH10.92、衍生溫度45.79 ℃、衍生時間40.41 min;精胺:pH10.82、衍生溫度43.91 ℃、衍生時間40.77 min;亞精胺:pH10.77、衍生溫度43.85 ℃、衍生時間40.48 min;尸胺:pH11.05、衍生溫度43.26 ℃、衍生時間39.95 min;組胺:pH10.83、衍生溫度46.71 ℃、衍生時間38.57 min。為方便統一操作,生物胺最優衍生條件設為pH11、衍生溫度45 ℃、衍生時間40 min。

在此條件下進行2個濃度(10、20 μg/mL)的3組平行實驗,腐胺、精胺、尸胺、亞精胺和組胺5種生物胺的實際峰面積響應與模型預測值的相對誤差數值介于2.32%～4.94%,均小于5%,說明模型能較好地預測生物胺的衍生效果,具有實際意義。

3 結論

本實驗在單因素優化基礎上,采用響應面設計方法建立了5種生物胺衍生化條件的響應面模型,模型擬合度高,預測值與實際值吻合好。根據模型參數的統計檢驗,各因素對衍生效果影響大小依次為pH、衍生溫度、衍生時間。最優衍生條件為pH11、衍生溫度45 ℃、衍生時間40 min。在此條件下進行驗證實驗,腐胺、精胺、尸胺、亞精胺和組胺5種生物胺的實際峰面積響應與模型預測值的相對誤差數值介于2.32%～4.94%,均小于5%,說明模型能較好地預測生物胺的衍生效果。本實驗優化得到的最優衍生條件對于高效液相色譜分析蜂蜜中的生物胺有實用價值。