分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定豆芽中6種喹諾酮類藥物

張今君,夏慧麗,高海波

(臺州市食品檢驗檢測中心,浙江臺州 318000)

豆芽是頗受百姓喜愛的芽菜類蔬菜之一,富含維生素C、礦物質、酚類化合物、游離氨基酸及微量元素,具有豐富的食用價值[1]。但豆芽在生產過程中極易滋生酵母、假單胞菌、大腸桿菌等微生物,易腐爛變質[2],因此一些不法商販為了縮短豆芽生長周期、增強抗菌能力、改善外觀品相,往往在豆芽生長過程中違規濫用植物生長激素、農藥、抗生素等藥劑,致使問題豆芽事件層出不窮。

目前,針對豆芽中赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2,4-2氯苯氧乙酸等植物生長調節劑的檢測,我國已經發布了相關補充檢驗方法[3];針對多菌靈、涕滅威、咪鮮胺等農藥殘留的檢測也有氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜-串聯質譜法等多個標準方法[4-6];針對喹諾酮類等抗生素藥物的檢測標準及文獻多以動物源性食品為主[7-14],適用范圍主要是畜禽肉、水產品及動物內臟等。而專門針對豆芽等植物源性食品中喹諾酮類等藥物殘留的文獻相對較少,檢測目標物相對單一,前處理方法主要是固相萃取、液液萃取等傳統方法[15-21],成本較高,操作過程耗時、繁瑣。因此,建立簡便快速、經濟有效,適于推廣的豆芽中多種喹諾酮類藥物殘留的測定方法,對于解決當前豆芽行業濫用藥物問題具有重要意義。

分散固相萃取法[22-24]簡單、快速、廉價、高效、安全,是近年來發展較快的農產品檢測樣品前處理方法,本文應用分散固相萃取,結合兼具高靈敏度、高選擇性的超高效液相色譜-質譜聯用技術,建立豆芽中6種喹諾酮類藥物殘留檢測方法。探討了提取條件、凈化填料用量、儀器條件參數、基質效應等影響因素,以期為豆芽中喹諾酮類等藥物殘留的檢測標準建立提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

陰性豆芽樣品 參照DB33 625.1-2007豆芽生產技術規程自培,綠豆(黃豆)經過清洗、殺菌(70～80 ℃熱水燙豆1～2 min)和浸豆(20～25 ℃的清水,綠豆3 h,黃豆6 h)后進行培育(溫度23～25 ℃,4 h淋水一次),4～6 d后采集豆芽樣品;80批次測試樣品 隨機采集于菜市場、農貿市場和超市;恩諾沙星(Enrofloxacin,純度99.0%)、環丙沙星(Ciprofloxacin,純度94.8%)、氧氟沙星(Ofloxacin,純度99.3%)、諾氟沙星(Norfloxacin,純度97.2%)、洛美沙星(Lomefloxacin,純度99.4%)、培氟沙星(Pefloxacin,純度93.9%)、恩諾沙星-d5(Enrofloxacin-d5)、環丙沙星-d8(Ciprofloxacin-d8)、氧氟沙星-d3(Ofloxacin-d3)、培氟沙星-d5(Pefloxacin-d5)、洛美沙星-d5(Lomefloxacin-d5)、諾氟沙星-d5(Norfloxacin-d5) 純度均大于95%,標準品,德國Dr.Ehrenstrorfer公司;乙腈、甲醇、甲酸 色譜純,美國Merck;去離子水 Milli-Q系統純凈水;N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)、無水硫酸鎂(MgSO4)、石墨化碳(GCB)分散固相萃取吸附劑 上海安譜實驗科技股份有限公司;氯化鈉 分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司。

QTRAP 5500三重四極桿-線性離子肼質譜系統 美國AB Sciex公司;UPLC液相色譜系統 日本島津公司;Microfuge 20離心機、Allegra X-30R冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司;渦旋混勻器 德國IKA;2150 TH超聲波儀 上海安譜;PR 1602 ZH/Z電子天平 奧豪斯電子天平有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線繪制 標準儲備液:準確稱取每種標準品各10 mg(精確至0.1 mg),分別置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,配制成濃度各為1 mg/mL標準儲備液,-18 ℃保存。

混合標準中間液:準確吸取上述標準品及同位素內標標準儲備液各25 μL置于25 mL容量瓶中,甲醇稀釋至刻度,配制成濃度均為1 μg/mL的混合標準中間液,-18 ℃保存。

標準工作溶液:吸取混合標準中間液10、50、100、500、1000 μL于10 mL容量瓶中,加入同位素內標中間液50 μL,用50%乙腈水稀釋至刻度得各目標物濃度為1、5、10、50、100 μg/L,內標物濃度為5 μg/L,現配。

按優化后條件進行測定,以標準品濃度為橫坐標,標準品與內標物峰面積比值為縱坐標繪制標準工作曲線。

1.2.2 樣品前處理 提取:稱取粉碎均勻的豆芽樣品10.00 g,置于50 mL具塞離心管中,添加200 μL同位素內標中間液,加入10 mL 1%甲酸乙腈溶液,渦旋振蕩10 min,加入4 g氯化鈉,渦旋混合1 min,在4 ℃下6000 r/min離心5 min,將上清液傾入50 mL具塞離心管,殘渣再用10 mL1%甲酸-乙腈溶液重復提取1次,合并上清液于50 mL離心管。

凈化:移取上層乙腈溶液1 mL置于裝有PSA 50 mg、C18100 mg、GCB 10 mg、MgSO4150 mg的分散固相萃取凈化管中,渦旋混合2 min,以6000 r/min離心5 min,取上清液0.5 mL加入0.5 mL水,渦旋混勻,經0.22 μm有機濾膜過濾后上機測試。

1.2.3 儀器條件 色譜條件:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱溫:35 ℃,流速:300 μL/min,進樣體積5 μL,流動相:A為含0.1%甲酸水溶液,B為甲醇。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

質譜條件:電噴霧離子源(ESI源);正離子掃描(ESI+);多反應監測(MRM);電噴霧電壓(IS)5500 V;霧化氣壓力(GS1)50 psi;輔助氣壓力(GS2)50 psi;氣簾氣壓力(CUR)35 psi;離子源溫度(TEM)550 ℃,各化合物定性離子、定量離子對及其碰撞能量等參數見表2。

表2 化合物的質譜參數

1.3 數據處理

各組分通過計算機在Multi Quant 3.0.2軟件上譜圖處理,通過各組分的離子比進行定性確證,采取內標法計算各組分的相對含量。數據使用Micro-soft Excel 2007軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 提取條件優化

2.1.1 提取溶劑的選擇 喹諾酮類化合物分子結構中含有羧基和叔氨基,具有酸堿兩性性質,易溶于酸性或堿性溶液。本實驗采用乙腈、1%甲酸乙腈、1%乙酸乙腈、1%氨水乙腈各20 mL分兩次對6種化合物進行提取,移取提取液0.5 mL,加入0.5 mL水渦旋混勻后過0.22 μm濾膜,檢測回收率。添加濃度20 μg/kg,結果顯示乙腈和氨水乙腈提取時各目標物回收率明顯低于酸性乙腈,其中甲酸乙腈的回收率最高,均高于85%,結果見圖1。實驗選用1%甲酸乙腈作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑對6種喹諾酮藥物回收率的影響

2.1.2 提取次數的選擇 本文用20 mL1%甲酸乙腈分20 mL 1次,10 mL 2次,7 mL 3次三個方案對豆芽樣品進行提取,移取提取液0.5 mL,加入0.5 mL水渦旋混勻后過0.22 μm濾膜,檢測回收率。添加濃度20 μg/kg,結果顯示,提取次數為2、3次時回收率均在89.90%～102.32%之間,各化合物提取效率高,結果見圖2。考慮操作簡便因素,選取10 mL 2次方案提取豆芽中化合物。

圖2 提取次數對6種喹諾酮藥物回收率的影響

2.2 凈化條件優化

PSA、C18、GCB、MgSO4是分散固相萃取常用的4種填料。本文參照植物源性食品中農藥及代謝物殘留量檢測的國家標準[25-26]設計不同用量對各目標物的回收率實驗。在1.2.2其它條件不變情況下單獨添加PSA、C18、GCB、MgSO44組填料各6個點進行回收率實驗,添加濃度20 μg/kg,重復測定3次,填料用量及回收率見圖3。PSA去除樣品中的脂肪酸、糖等干擾物,對各目標物也有一定的吸附,在使用量50 mg之后對目標物吸附增加;C18去除樣品中脂肪等非極性干擾物,在25～150 mg范圍對各目標物吸附量穩定。GCB用量從10 mg上升至15 mg時各目標物回收率下降至60%以下;MgSO4在50～300 mg范圍對各目標物吸附量影響較小。綜合考慮回收率及除雜效果,選用PSA 50 mg、C18100 mg、GCB 10 mg、MgSO4150 mg組成分散固相萃取凈化管,各目標物回收率較高。

圖3 4種凈化填料用量對6種喹諾酮藥物回收率的影響

2.3 儀器條件優化

2.3.1 色譜條件的優化 喹諾酮類藥物在正離子模式下進行測定,流動相中加入甲酸可以提高離子化效率,選擇甲酸水溶液為水相流動相,對甲醇/甲酸水和乙腈/甲酸水進行比較,結果表明甲醇/甲酸水峰形尖銳,信號更高,本實驗選擇甲醇/0.1%甲酸水作為流動相,對梯度條件進行優化,采用優化后梯度洗脫方法,可以得到滿意的實驗結果。豆芽加標樣品中提取離子色譜圖見圖4。

圖4 20 μg/kg豆芽加標樣品中MRM離子流圖

2.3.2 質譜條件的優化 質譜條件優化時,去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)這兩個參數與化合物性質相關且影響較大。喹諾酮化合物中含有叔氨基,容易得到質子,因此選擇正離子模式進行檢測。實驗將0.1 μg/mL各標準溶液經蠕動泵以7 μL/min流速進入ESI源進行質譜分析。通過Q1全掃模式獲得分子離子峰,用子離子模式對分子離子峰進行分析,從打碎的離子中選取兩個特征離子作為定性和定量離子。用MRM掃描模式優化DP和CE值,使得定量與定性離子強度響應最大,優化后的6種喹諾酮藥物及同位素內標物質譜參數見表2。

2.4 基質效應評價

質譜分析中,由于流動相、目標物與樣品中的其他成分同時進入質譜系統,進而影響了目標離子的離子化過程,使得目標物的質譜信號增強或者減弱,從而影響了分析結果的準確性和精密度[27]。本實驗采用Guedes等[24]報道的方法對基質效應進行考察,在建立的前處理方法和儀器測定條件下,測定空白基質提取液與溶劑中同濃度目標物的響應值,通過目標物與內標物峰面積之比的相對比值評價。基質效應按照式(1)計算。6種喹諾酮藥物在豆芽基質中的基質效應見表3,結果顯示各化合物基質效應在0.97～1.04之間。本實驗基質效應小,可選擇溶劑配制標準工作溶液。

表3 6種喹諾酮藥物的基質效應

式(1)

式中,ME表示基質效應的大小,當ME大于1.0時為基質增強,當ME小于1.0時為基質抑制;Am為基質提取液中化合物峰面積,Ami為基質提取液中同位素內標峰面積,As為溶劑中化合物峰面積,Asi為溶劑中同位素內標峰面積。

2.5 方法學驗證

2.5.1 檢出限、定量限和線性范圍 將6種喹諾酮類藥物的標準溶液稀釋成不同的濃度,以標準品與內標物峰面積比值對應各自濃度進行線性回歸,同時利用豆芽空白基質進行檢出限和定量限的考察,以3倍和10倍信噪比確定6種喹諾酮類藥物的檢出限和定量限。結果表明,6種喹諾酮藥物在1.0～100.0 μg/L的濃度范圍內線性關系良好,相關系數均大于0.9982,檢出限為0.1～0.3 μg/kg,定量限為0.3～1.0 μg/kg,具體見表4。

表4 6種喹諾酮藥物的相關系數、檢出限及定量限

2.5.2 回收率及精密度 在豆芽空白基質中添加不同濃度的6種喹諾酮類標準溶液進行加標回收實驗,分別添加2、4、20 μg/kg三個濃度水平,每個樣品平行測定6次,數據結果見表5。結果表明6種喹諾酮藥物回收率均在96.53%～106.94%之間,相對標準偏差在2.73%～7.60%之間,符合GB/T 27404《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》標準[28]要求。

表5 6種喹諾酮藥物回收率及精密度(n=6)

2.5.3 實際樣品測定 用建立的方法對從市場采集的80批次豆芽樣品中的6種喹諾酮類藥物進行測定,其中恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星有檢出,檢出率分別為37.5%、26.2%、2.5%,氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星均未檢出,具體情況見表6。

表6 80批次豆芽中6種喹諾酮藥物檢測結果

3 結論

本實驗采用1%甲酸乙腈提取,PSA 50 mg、C18100 mg、GCB 10 mg、MgSO4150 mg分散固相萃取凈化,同位素內標法定量,建立了同時測定豆芽中6種喹諾酮藥物的高效液相色譜-串聯質譜的分析檢測方法。結果表明,各藥物在1.0～100.0 μg/L濃度范圍內的線性關系良好,相關系數均大于0.9982,三個添加水平的回收率范圍為96.53%～106.94%,相對標準偏差為2.73%～7.60%,檢出限為0.1～0.3 μg/kg,定量限為0.3～1.0 μg/kg。80批次豆芽樣品中恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星檢出率分別為37.5%、26.2%、2.5%,氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星均未檢出。本方法操作簡單,準確度和精密度高,適合豆芽中喹諾酮類藥物的定性和定量檢測,可為芽菜類蔬菜中喹諾酮類藥物殘留的風險評估提供一種快速高效的分析手段。