葡萄果皮提取物對砷致雄性小鼠生殖毒性的緩解作用

閆志鵬,高俊宇,王瑞廷,儀慧蘭

(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

砷是一種具有致癌性的有毒元素,可通過多種途徑進入人體,通過飲用水攝入砷是最主要的途徑之一[1-2]。據不完全統計,全球有105個國家和地區約2億多人的飲用水中砷含量超過世界衛生組織(WHO)規定的限值10 μg/L[3]。人體長期接觸砷化合物會誘發皮膚、心血管、生殖系統及神經系統等疾病與癌癥的發生[4]。流行病學調查顯示,長期砷暴露可導致男性精子質量下降,增加男性不育癥風險[5-7];動物實驗發現,飲用水砷暴露可致雄性小鼠精子質量和數量降低,睪丸組織損傷[8-9]。目前研究認為,砷的毒性與其引發的機體氧化損傷有關[10],因此,通過改變機體抗氧化能力有可能降低砷攝入引發的毒性。

研究發現,葡萄果皮提取物(Grape skin extracts,GSE)具有較強的抗氧化活性,其中的酚酸類、黃酮(醇)類和芪類等植物多酚是主要的活性成分[11-12]。GSE具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、保護肝臟和心血管等多種生理活性[11]。玫瑰香GSE具有較強的體外抗氧化能力,對小鼠肝臟自發性脂質過氧化也有較好的抑制作用[13-14];葡萄籽和果皮提取物對砷誘導的大鼠心臟氧化應激具有保護作用[15],葡萄籽提取物原花青素可以緩減砷引發的雄性生殖毒性[16],但關于葡萄果皮提取物能否拮抗砷的生殖毒性未見報道。

前期實驗選用果皮色澤較深的玫瑰香葡萄,采用超聲波輔助提取技術得到了體外抗氧化能力較強的果皮提取物[13]。本研究用該果皮提取物干預砷攝入引發的雄性小鼠生殖毒性,以期為砷的生殖毒性防控提供依據,同時也為葡萄果皮提取物的開發利用拓展新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GSE 采用本實驗室前期建立的方法提取,濃度以總花色苷濃度標識[13];健康雄性昆明種純系小鼠24只,體重(18±2) g 購于山西省腫瘤醫院,生產許可證號:SCXK(晉)2017-0001;亞砷酸鈉 美國Sigma公司;乙醇、甲醇、甲醛、二甲苯、蘇木精、氯化鈉、考馬斯亮藍 為國產AR級試劑;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所;戊巴比妥鈉99.03% 上海倍卓生物科技有限公司。

SB-3200超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;HC-2518R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;RE-52A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;精密pH計 安萊利斯儀器科技(上海)有限公司;SynergyH1多功能酶標儀 美國BioTek;Olympus BX41熒光生物顯微鏡 日本Olympus。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組與處理 將小鼠按體重隨機分為4組,每組6只。第一組為陰性對照組(CK),飲蒸餾水;第二組為砷染毒組(As),飲水含10 mg/L砷(用NaAsO2配制);第三組為GSE干預組(As+GSE),在飲用10 mg/L砷的同時,隔天1次灌胃4.5 mg GSE/kg·BW,該劑量是依據GSE的體外抗氧化能力選擇的[13];第四組為GSE對照組,隔天1次灌胃4.5 mg GSE/kg·BW。實驗周期60 d,實驗期間小鼠自由取水、攝食,染毒結束前12 h禁食。

1.2.2 實驗動物的取材 參照Zeng等[9]的方法,將小鼠麻醉、稱重后解剖,取附睪用于制備精子懸液,取雙側睪丸用預冷的生理鹽水清洗,稱重。將左側睪丸用4%的中性甲醛溶液固定,右側睪丸冷凍于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 精子數量和形態的觀察 取雙側附睪,參照Zeng等[9]的方法,制備精子懸液計數精子總數,并制備精子涂片,顯微鏡下觀察統計正常和畸形精子數目。每只小鼠計數約1000個精子,計算精子畸形率。

1.2.4 睪丸組織切片與觀察 參照Zeng等[9]的方法,取甲醛固定的睪丸組織,制備石蠟切片,經蘇木素-伊紅染色,光學顯微鏡觀察。

1.2.5 睪丸組織氧化脅迫指標測定 取凍存的睪丸組織,加預冷的生理鹽水制成10%的組織勻漿液。采用試劑盒檢測SOD活性、GSH含量、H2O2和MDA濃度。用考馬斯亮藍比色法測定蛋白含量[17]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 實驗小鼠的一般情況

實驗期間,小鼠毛發順暢,行走、飲食與對外界反應均正常,未出現死亡。As染毒組小鼠每日飲水量平均為5.54 mL/只,各組間飲水量無明顯差異。實驗結束時各組小鼠的體重無明顯差異。由飲水量計算可知,小鼠平均每天攝入砷的量為1.718 mg/kg·BW。

2.2 砷對小鼠睪丸系數和精子總數的影響及葡萄果皮提取物的干預效應

As組小鼠睪丸系數顯著低于蒸餾水對照組(P<0.05),說明砷攝入可導致睪丸組織萎縮;采用GSE干預后小鼠的睪丸系數略高于As組,與對照組水平相當,說明GSE對砷致睪丸萎縮有一定的緩減作用(圖1)。

圖1 葡萄果皮提取物對小鼠睪丸臟器系數的影響

經精子計數發現(圖2),As組小鼠的精子總數減少,顯著低于蒸餾水對照組(P<0.05),表明砷攝入能減少小鼠的精子數量,與其它小鼠品系中得到的結果一致[8-9];采用GSE干預后小鼠的精子總數顯著提高(P<0.05),與對照組無顯著性差異(P>0.05),表明GSE能有效改善砷攝入引發的小鼠精子減少。

圖2 葡萄果皮提取物對小鼠精子總數的影響

2.3 砷對小鼠精子的致畸作用及葡萄果皮提取物的干預效應

精子形態觀察發現(圖3),As組中7種精子畸變類型的比率均高于對照組,總精子畸形率顯著高于蒸餾水對照組(P<0.05),是對照組的2.25倍。其中,尾折疊畸形率最高,其次是不定型頭、香蕉頭、胖頭和無鉤,雙頭和雙尾畸形率相對較低。GSE干預組的精子畸形率顯著低于As組(P<0.05),說明一定劑量的GSE能夠緩解砷對小鼠精子的損傷。

圖3 葡萄果皮提取物對小鼠精子畸形率的影響

2.4 砷對小鼠睪丸組織結構的損傷及葡萄果皮提取物的干預效應

光學顯微鏡下,對照組小鼠睪丸組織生精小管排列規則、緊密,生精上皮細胞結構完整、排列緊密且層次分明,各發育階段精細胞均可見,管腔內有大量成熟精子(圖4A);As組生精小管間間隙增大,基膜出現破損,生精細胞排列疏松且不規則,生精小管管腔內成熟精子較少(圖4 B);GSE對照組結構正常(圖4D),GSE干預組與As組相比,生精小管間間隙較小,基膜完整性較好,生精小管內生精細胞排列較規整,生精小管管腔內成熟精子數量有所增加。

圖4 葡萄果皮提取物對小鼠睪丸組織病理的影響(200×)

2.5 砷對小鼠睪丸組織的氧化損傷及葡萄果皮提取物的干預效應

SOD和GSH是生物體抗氧化系統的主要成員,在機體受到氧化脅迫時,體內的SOD活性和GSH含量會誘導性增高,參與對活性氧的清除,以維持機體的氧化還原平衡。本研究中,As組小鼠睪丸組織SOD活性和還原型GSH含量顯著降低(P<0.05),H2O2和MDA濃度顯著升高(P<0.05),說明砷暴露使睪丸組織中活性氧水平升高,引發抗氧化能力降低和組織氧化損傷效應。采用GSE干預后,睪丸組織中SOD活性和還原型GSH含量顯著升高(P<0.05),H2O2和MDA濃度顯著降低(P<0.05),表明攝入GSE能提高組織的抗氧化能力,從而減輕砷的氧化損傷效應。

圖5 葡萄果皮提取物對小鼠睪丸組織氧化脅迫指標的影響

3 討論與結論

飲用水砷攝入影響著2億多居民的健康,阻止或干預砷毒性對于改善砷攝入人群的健康狀況至關重要。小鼠飲用含砷5或50 mg/L的水6個月后,血清睪酮水平降低,精子質量下降、數量減少,睪丸組織結構出現病理性損傷[9]。本研究中昆明種小鼠飲用含砷10 mg/L的水60 d后,As組小鼠得到與C57BL/6小鼠[9]一致的結果,說明砷對實驗動物的生殖毒性具有普遍性,文中建立的昆明小鼠生殖毒性模型具有較好的代表性。本實驗采用一定劑量的GSE進行干預后,砷對小鼠的雄性生殖毒性被抑制,表明本研究選用的GSE能有效緩解砷的生殖毒性。

在深色葡萄果皮中酚酸類物質約占到果皮多酚的70%以上,主要包括香豆酸、沒食子酸和咖啡酸等,黃酮類及黃酮醇類約占20%,主要包括槲皮素、山奈酚和原花青素等,芪類物質含量較少,大部分為白藜蘆醇及其反式異構體[18]。研究發現,白藜蘆醇可以通過降低肝臟中的砷積累和氧化應激來緩減As2O3的肝毒性[19],兒茶素和鞣花酸對砷致小鼠生殖毒性具有緩解效果[20-21],高劑量的原花青素對砷致雄性小鼠生殖毒性具有明顯的拮抗作用[22]。本研究在小鼠攝入砷的同時用玫瑰香GSE進行灌胃干預,可使睪丸組織的抗氧化能力提高、砷的雄性生殖毒性降低,說明砷的生殖毒性與氧化損傷效應有關,灌胃GSE能提高機體抗氧化能力、緩解砷的生殖毒性,GSE含有的多種活性成分在機體解毒過程中發揮了重要作用。

研究表明,砷引起的機體損傷是自由基的過量產生和內源保護性抗氧化能力降低共同作用的結果[23]。本研究中As組小鼠睪丸組織SOD活性和還原型GSH含量降低,H2O2和MDA濃度提高,說明經飲用水攝入砷對小鼠睪丸組織造成了氧化損傷,砷暴露能誘導睪丸組織產生過多的活性氧自由基;清除活性氧需要消耗體內的SOD和還原型GSH,同時砷和自由基對巰基具有較強的結合力,導致細胞還原力下降;而大量自由基堆積可引起脂質過氧化程度加重,使MDA濃度增高。在本研究中,給砷攝入小鼠灌胃GSE能提高小鼠睪丸組織的SOD活性和還原型GSH含量,降低H2O2和MDA濃度,可能是GSE中的酚酸類成分、維生素C等能夠通過供氫、淬滅單線態氧、螯合以及還原等作用清除自由基[12],從而保護了抗氧化酶和非酶系統的活性,提高了組織的抗氧化能力,繼而對組織器官的功能和結構進行保護,表現為睪丸系數、精子總數與質量的改善。

本研究結果表明,飲用水攝入砷可引發雄性生殖毒性,導致睪丸組織抗氧化能力降低、組織結構損傷,精子質量和數量降低。葡萄果皮提取物對砷攝入引起的雄性生殖毒性具有良好的緩解作用,能改善組織的抗氧化能力,提高精子質量和數量,保護睪丸組織結構。