miR-146a基因多態性與帕金森病的相關性分析

趙 杰，余巧燕，王潤青

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種臨床常見神經系統變性疾病，好發于老年人，多以腦黑質多巴胺(dopamine，DA)能神經元的變性死亡為主要病理改變，嚴重影響老年人生活質量并給社會帶來嚴重經濟負擔[1～3]。PD具體病因尚不明確，目前認為其可能與環境因素、遺傳因素、氧化應激、年齡老化及神經炎癥等有關[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)在進化過程中高度保守，可通過影響轉錄進程調節其靶基因表達。miR-146a在炎癥信號通路中起重要作用，研究報道其在癲癇、阿爾茲海默癥、PD、缺血性腦卒中等疾病中發揮重要作用[5～8]，但關于miR-146a單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)與PD的關系尚鮮有研究。因此本研究擬探究miR-146a rs2910146、rs5709329位點與PD的相關性，以期從基因層面探究其發病機制及臨床意義。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用病例對照研究，選取2015年10月-2019年8月本院連續就診和住院治療的原發性PD患者446例(PD組)，其中男性214例，女性232例，平均年齡(62.94±8.65)歲，平均身體質量指數(body mass index，BMI)為(24.17±2.18)kg/m2，平均受教育年限為(9.36±3.54) y，首發肢體左側者211例，右側者235例。按照中文版蒙特利爾認知評估量表(Montreal Cognitive Assessment，MoCA)將PD患者分為認知正常組(≥26分，n=237)和障礙組(<26分，n=209)；根據運動障礙分為姿勢步態障礙型(n=206)、震顫型(n=178)和中間型(n=62)3個亞型。另匹配同期健康體檢中心健康體檢者450例為對照組，其中男性243例，女性207例，平均年齡(62.17±8.92)歲，平均BMI為(23.96±2.25)kg/m2，平均受教育年限為(9.48±3.27) y。收集所有受試者臨床資料，本研究經過本院道德倫理委員會批準通過，所有樣品采集及資料調查均取得患者及其家屬知情同意并簽字確認，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 納入與排除標準 PD患者納入標準：(1)符合中華醫學會神經學會PD及運動障礙學組制定的關于原發性PD診斷標準[9]；(2)年齡30歲～85歲；(3)均為漢族無血緣關系的本地常住居民。對照組納入標準：(1)無神經相關疾病及家族史者；(2)年齡30歲～89歲；(3)漢族，無血緣關系。

排除標準：(1)合并腦血管疾病、阿爾茲海默癥病史及其他精神疾病者；(2)有服用抗精神病藥物史者；(3)有PD家族病史者；(4)臨床資料不完整者。

1.3 樣本采集及miR-146a基因型檢測 采取所有受試者清晨空腹肘正中靜脈血4 ml置于-80 ℃保存待檢。采用全基因組DNA提取試劑盒(貨號：158422，英國QIAGEN公司)提取所有受試者血液DNA，置于-20 ℃冰箱保存備用。miR-146a rs2910146位點上游引物序列(5′→3′)：AACTGAATTCCATGGGTTG，下游引物序列(5′→3′)：CACGATGACAGAGATATCCC；rs5709329位點上游引物序列(5′→3′)：CGGGGCTGCGGAGAGTCTAG，下游引物序列(5′→3′)：GGACCCTCTTGCACACGTGTC。反應體系(25 L)：10×PCR Buffer 5.0 L，上下游引物(10 mol/L)各1 L，dNTP 4.0 L，DNA(10 mol/L)10 L，Taq DNA 聚合酶 0.25 L，ddH2O 3.75 L。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，64 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物置于4 ℃保存。采用DNA純化回收試劑盒(貨號：DP214-3，北京天根生化科技有限公司)純化回收后送上海生工生物工程股份有限公司進行基因測序。

2 結 果

2.1 PD組與對照組基線資料比較 PD組與對照組性別、年齡、BMI、文化程度比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性(見表1)。

表1 PD組及對照組基線資料比較

2.2 PD組與對照組miR-146a rs2910146、rs5709329位點等位基因頻率、基因型分布 PD組與對照組miR-146a rs2910146、rs5709329位點基因型分布均符合哈代-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡定律(χ2=4.617、1.047、0.835、1.405，P>0.05)，具有群體代表性。與對照組比較，PD組rs2910146位點G等位基因、GG基因型頻率顯著降低(P<0.05)。PD組與對照組rs5709329位點等位基因頻率、基因型分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 miR-146a rs2910146、rs5709329位點等位基因頻率、基因型分布[n(%)]

續表2

2.3 miR-146a rs2910146位點SNP與PD患者認知功能障礙的關系 與正常組比較，認知功能障礙組PD患者miR-146a rs2910146位點G等位基因、GG基因型頻率顯著降低(P<0.05)(見表3)。

表3 認知功能障礙組與正常組PD患者miR-146a rs2910146位點等位基因頻率、基因型分布比較[n(%)]

2.4 miR-146a rs2910146位點SNP與PD臨床參數的關系 miR-146a rs2910146位點SNP分布與PD患者年齡有關(P<0.05)，與性別、PD亞型、首發肢體無關(P>0.05)(見表4)。

表4 miR-146a rs2910146位點SNP與PD臨床參數的關系 [n(%)]

2.5 Logistic回歸分析影響PD發生的危險因素 采用Logistic回歸分析校正年齡后，結果發現攜帶GG基因型是PD發生的獨立保護因素(P<0.05)(見表5)。

表5 Logistic回歸分析影響PD發生的危險因素

3 討 論

PD在65歲以上人群中發病率約2%，隨著中國社會老齡化人口加劇，PD發病率和致殘率呈逐年上升趨勢，給患者家庭及社會帶來沉重經濟負擔。目前普遍認為，PD是由環境及基因共同作用引起的一種運動障礙性疾病[10]。趙西耀等[11]研究報道，自噬相關基因7 rs14016位點TT基因型及T等位基因可增加PD發病風險。王慶廣等[12]研究報道，α-突觸核蛋白中rs356219、rs356165位點多態性在PD發病中發揮著重要作用。近來miRNA與多種疾病發生發展關系備受關注，miR-146a是免疫應答及炎性反應中重要調控因子，可通過Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)信號通路介導，靶向TLR4、CD40配體(CD40 ligand，CD40L)等發揮炎癥調節作用，促進Th1細胞分化等。SNP是一種在人類基因組中密集分布的分子標記，其多樣性常用于與疾病關聯分析。miR-146a多態性被證實與多種癌癥、炎癥性疾病等有關[13～15]。其中rs2910146位點及rs5709329位點均是其功能SNP位點，二者均可影響體內成熟miR-146a轉錄水平[16，17]。程衍楊等[18]研究報道，miR-146a rs5709329位點SNP與兒童癲癇發病有關，rs2910146位點SNP與兒童癲癇易感性無關。尹曉剛等[19]研究報道，miR-146a rs5709329位點SNP與老年癲癇易感性和發作頻率無關。但關于miR-146a基因多態性與PD的相關性尚鮮有報道。本研究結果發現，與對照組比較，PD組rs2910146位點G等位基因、GG基因型頻率顯著降低；PD組與對照組rs5709329位點等位基因頻率、基因型分布比較，差異無統計學意義，提示PD組rs2910146位點可能與PD發生有關，rs5709329位點與PD發生無相關性，與文獻報道不完全一致，可能與地理位置差異及病例選擇異質性等有關。

PD不僅會誘發運動障礙，還可導致患者癡呆、認知功能障礙等。本研究還發現，與正常組比較，認知功能障礙組PD患者miR-146a rs2910146位點G等位基因、GG基因型頻率顯著降低，另miR-146a rs2910146位點SNP與PD患者年齡有關，與性別、PD亞型、首發肢體無關，PD患者根據發病年齡50歲為界分為早發型和晚發型，然而早發型PD較少見，我國65歲以上人群PD發病率可達2%，可能與年齡老化、多巴胺能神經元變性死亡有關，提示miR-146a rs2910146位點與年齡及PD患者認知功能障礙有關。本研究進一步采用Logistic回歸分析校正年齡后，結果發現攜帶GG基因型是PD發生的獨立保護因素，提示miR-146a rs2910146位點可能與PD易感性有關，攜帶GG基因型可降低PD發生風險。

綜上所述，miR-146a rs2910146位點SNP與PD患者年齡、認知障礙有關，攜帶GG基因型可能降低PD發生風險。但由于本研究樣本量少、病例選擇范圍局限，存在不足，不同種族及不同地域研究對象可能結果不完全一致；另PD發生機制復雜，可能涉及多種基因共同作用，有待后期加大樣本量進一步深入探究。