牛輪狀病毒VP4基因RT-qPCR檢測方法的建立

拜小強，耿金靜，白生菊，魏鎖成*，李瓊毅

(1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030)

輪狀病毒（Bovine rotavirus，BRV）是引起哺乳期犢牛群發病毒性腹瀉的主要病原之一，約占犢牛腹瀉病例的46%[1]。7日齡內的新生犢牛因消化系統和免疫系統尚未發育完全，而易發感染且病癥嚴重，以食欲廢絕、消化道機能紊亂及水樣糞便為典型臨床癥狀[2]。該病毒具有株型眾多、易發重排、宿主廣泛、傳播迅速等生物學特性，加之該病致死率最高達50%，尚無高效疫苗和特效藥物，使得牛養殖業遭受了巨大的經濟損失[3]。另外，已證實RV可在人畜間交叉傳播，也對人類公共衛生安全存在潛在威脅[4-7]。

BRV為雙鏈RNA病毒，屬呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬成員，病毒粒子呈直徑60～80 nm的二十面體立體對稱結構，其雙鏈RNA基因組由11個不連續的基因片段組成，共編碼6個結構蛋白（VP1～4、VP6、VP7）和6個非結構蛋白（NSP1～6）[8]。其中第4片段編碼的VP4黏附蛋白，由776個氨基酸組成，相對分子量約為88 kDa，現已被證實與BRV的毒力、血凝作用及抗原特性存在密切聯系[9]。有研究表明，輪狀病毒入侵宿主細胞過程中，VP4蛋白被胰蛋白酶水解為VP5和VP8兩個多肽[10]。VP5(60 kDa)與病毒吸附及侵入功能相關，進而破壞細胞抑制機制，而VP8（28 kDa）含血凝素抗原和中和抗原，聚集著VP4的主要抗原位點，在疫苗研發過程中發揮著至關重要的作用[11]。因此，經胰酶消化激活的VP4結構蛋白使得BRV的致病性大大增強[12]。輪狀病毒株型眾多，根據VP4抗原特性，將BRV分為不同的P型（P-serotype）[13]，基于VP4的分型功能和抗原特性，該基因片段可用作BRV的檢測靶點，為建立特異的病原檢測方法提供了理論支持。目前，實驗室檢測BRV的方法主要有經典病原檢測（電鏡和病毒分離）、免疫學檢測（ELISA）和基因檢測（PCR）三類，熒光定量PCR能快速鑒別診斷病原，具有靈敏度高、特異性強、可實時定量監控等優點，被用于目的基因測試、基因表達分析、病原體檢測中[14]。本研究以BRV VP4基因作為檢測靶基因設計引物，建立了EvaGreen熒光定量RT-PCR檢測方法，為牛輪狀病毒的快速檢測診斷提供一種經濟高效的檢測手段。

1 試驗材料與方法

1.1 毒株、細胞及病料

牛輪狀病毒NCDV株購自中國獸醫微生物菌種保藏中心（保存編號：AV51），MA-104細胞接毒培養物-80℃保存；感受態細胞BL-21、牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛冠狀病毒（Bovine coronavirus，BCV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和牛結核分枝桿菌（Mycobacterium bovis，MB）保存于西北民族大學生物工程與技術國家民委重點實驗室；1月齡以下犢牛腹瀉（持續腹瀉3 d以上）糞便樣品共47份采集自甘肅蘭州市、張掖市和甘南州。

1.2 主要試劑

主要試劑和來源見表1。

1.3 病料樣本處理

將采集的犢牛腹瀉糞便樣品與PBS按1∶10混合，渦旋振蕩混勻后25℃、3 000 rpm離心20 min，吸取上清液，按輪狀病毒診斷試劑盒(酶聯免疫法)說明書步驟進行定性檢測，測得的陽性樣品保存于-80℃冰箱中。

1.4 引物設計

參考Genbank（Accession：JF693029）發表的BRV VP4核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0設計引物（BRV-VP4-F/BRV-VP4-R），經NCBI Primer-BLAST分析驗（見表2），完成設計的引物交由北京擎科生物技術有限公司合成。

1.5 重組質粒標準品制備

取BRV毒液和ELISA檢測陽性樣本，用病毒RNA提取試劑盒提取RNA，反轉錄得cDNA作為模板進行PCR，產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證，凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶連接至pMD 18-T克隆載體，用質粒提取試劑盒提取質粒，送北京擎科生物技術有限公司測序。經核酸蛋白檢測系統測定的陽性重組質粒保存于-20℃備用。

表1 主要試劑和來源

表2 引物序列信息

1.6 優化反應條件

RT-qPCR反應體系：EvaGreen RT-qPCR Master Mix 25 μl；上下游引物（BRV-VP4-F/R）各1 μl；待測cDNA模板5 μl；DEPC水18 μl；總體積50 μl。對設定的變性、退火、延伸反應條件進行系統優化。pMD 18-T-VP4質粒標準品以10-1～103共5個梯度稀釋（copies/μl）后重復3次EvaGreen熒光定量檢測，建立橫軸為模板起始拷貝數對數值，縱軸為Ct值的標準曲線。

1.7 敏感性檢測

對構建的pMD 18-T-VP4質粒標準品進行 10-1、100、101、102和103梯度稀釋，用優化后的反應條件進行3次重復檢測，對比分析得出最低檢測限度。

1.8 特異性試驗

用建立的EvaGreen熒光定量檢測方法對BRV、BVDV、BCV、CSFV、PEDV和MB進行檢測，每個樣品做3次重復試驗，同時設置空白和陰性對照。

1.9 重復性試驗

對pMD 18-T-VP4質粒標準品作5個倍比稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5），進行RT-qPCR檢測，記錄Ct值，根據建立的標準曲線可得出VP4基因含量（copies/μl）。組內重復試驗：將5個梯度稀釋的陽性質粒進行RT-qPCR檢測，以標準曲線方程計算拷貝數，每個濃度重復測量3次，求組內平均值、標準差和變異系數。組間重復試驗：不同質粒含量的標準品進行RT-qPCR 3次獨立重復試驗，求組間平均值、標準差和變異系數。

2 結果

2.1 BRV VP4基因的擴增

以反轉錄的cDNA為模板，用VP4基因引物進行擴增，經瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果表明擴增的條帶約為890 bp，與測序結果一致（見圖1）。

圖1 VP4基因擴增條帶

2.2 RT-qPCR標準曲線

對建立的RT-qPCR反應條件進行優化，最佳反應條件：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，共40個循環；72 ℃再延伸10 min。以優化后的RT-qPCR檢測5個不同濃度（10-1～103）的重組質粒pMD 18-T-VP4，其Ct值分別為29.02、25.35、20.78、17.86和14.73。得出標準曲線（見圖2）。

圖2 重組質粒標準曲線

標準曲線的斜率為-3.425，截距為30.86，相關系數 R2=0.992，Ct值之間呈良好的線性關系。回歸方程為Y=-3.425X+30.86；X為陽性質粒模板拷貝數以10為底的對數值。從而可以得出X與Ct值之間的線性關系曲線方程式為Ct=30.86-3.425X。不同濃度重組質粒的Ct值，從試驗結果中直接讀取，Ct值代入標準曲線方程可計算出VP4初始拷貝數。

表3 RT-qPCR檢測BRV VP4重復性試驗結果

2.3 敏感性試驗結果

5個梯度稀釋（10-1～103）的pMD 18-T-VP4質粒標準品的Ct值分別為29.02、25.35、20.78、17.86和14.73，用標準曲線方程計算出的拷貝數分別為1.72×103、3.25×102、5.76×101、7.21×100和9.36×10-1，表明該方法的最低檢出量為7.21 copies/μl。

2.4 特異性試驗結果

用建立的RT-qPCR檢測BRV、BVDV、BCV、CSFV、PEDV和MB。試驗結果顯示，僅BRV出現擴增曲線，其他病毒和細菌無任何擴增，陰性對照亦無擴增，即只對BRV的cDNA有良好的擴增，表明建立的方法有良好的特異性（見圖3）。

圖3 BRV RT-qPCR特異性檢測

2.5 重復性試驗結果

通過對5個稀釋度的pMD 18-T-VP4重復檢測，組內CV為0.95 %～1.12 %；組間CV為1.55 %～2.18%（見表3），表明RT-qPCR方法穩定可靠。

2.6 臨床樣本檢測

應用本研究建立的RT-qPCR檢測方法檢測21份ELISA陽性糞樣，結果顯示：19份呈陽性，2份為陰性，與ELISA檢測的陽性符合率為90.47 %。

3 討論

輪狀病毒在人與動物、不同動物之間有一定的交叉感染，嬰幼兒和低齡動物容易通過糞-口途徑感染RV，造成小腸絨毛縮短，絨毛上皮細胞凋亡，機能減退為病癥的急性胃腸道傳染病[14,15]。在牛群中感染A組輪狀病毒最為常見[16]，1980年福建畜牧獸醫研究所首次在我國發現BRV的存在[17]，隨后在各地牛群中陸續分離出不同株型的BRV[18-20]，以G10和G6株型最為普遍[21]。VP4基因編碼衣殼黏附蛋白，通常根據VP4確定BRV的基因型。盡管VP4蛋白在病毒蛋白總量的約為1.5 %[22]，但同基因型毒株比對，VP4的核苷酸序列和氨基酸序列高度保守，同源性可達94.6 %～97.8 %[23]，在保證病毒毒力的情況下，可以將該基因作為靶基因進行BRV病原檢測。持續感染（PI）動物是主要的傳染源，成年牛只隱性感染BRV且持續排毒，能高效、準確地檢測隱性持續感染動物成為阻斷BRV傳播、凈化牛養殖場的關鍵一步。

實時熒光定量PCR根據熒光信號的變化對PCR過程進行實時監控，在畜禽傳染病原檢測中得到廣泛的應用[24-26]。目前以VP4基因作為靶點建立的BRV熒光定量PCR報道較少，本試驗應用相對保守的VP4基因作為檢測靶點，擴增目的片段后連接載體，重組獲得質粒標準品，稀釋后繪制標準曲線。建立的RT-qPCR最低檢測量為7.21 copies/μl；同步檢測5種病毒/菌均無擴增曲線，陰性對照亦無擴增；組內重復和組間重復變異系數分別為0.95%～1.12 %和1.55%～2.18%；應用該方法檢測21份ELISA陽性樣本，檢測符合率為90.47 %。經臨床樣品檢測，證實本方法可行，為牛輪狀病毒的初步篩查診斷提供了一種可參考的檢測手段。